宋 陽(yáng)，朱凌羽，李若楠，鄭 鑫

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

炎癥反應(yīng)是一種復(fù)雜的生物學(xué)、生理學(xué)和病理學(xué)反應(yīng)。一方面是對(duì)損傷的正常生理反應(yīng)，可以抵御入侵的病原體，沒(méi)有炎癥反應(yīng)，傷口和感染無(wú)法痊愈；但另一方面，不受控制的炎癥反應(yīng)是有害的，隨著炎癥反應(yīng)的不斷增強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致宿主組織損傷和疾病，如急性或慢性炎癥、自身免疫性疾病或癌癥[1]，因此是一把雙刃劍。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是來(lái)自革蘭陰性細(xì)菌外葉的典型內(nèi)毒素[2]，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)。在炎性刺激物L(fēng)PS暴露時(shí)，與 Toll樣受體 (Toll-like receptors，TLR)結(jié)合，巨噬細(xì)胞被激活，核因子?κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化，導(dǎo)致促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子以及活性氧物質(zhì)的大量產(chǎn)生。此外，主要的促炎細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子?α(Tumour necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素?6(Interleukin- 6，IL-6)和白細(xì)胞介素?1β(Interleukin-1β，IL-1β)，在 LPS 刺激的巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致各種炎癥性疾病的發(fā)生[3-4]。因此，能夠有效抑制NF-κB活化，使促炎細(xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，是治療炎癥反應(yīng)的潛在策略?，F(xiàn)如今，大多數(shù)合成抗炎藥價(jià)格昂貴，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生胃腸道和呼吸道刺激、腎毒性、身體依賴性和便秘等不良反應(yīng)。所以，急需尋找具有低毒性和更好耐受性的經(jīng)濟(jì)有效的天然藥物，來(lái)避免長(zhǎng)期服用合成抗炎藥所造成的毒副作用和成本上升。蝦青素(Astaxanthin，AST)屬于類(lèi)胡蘿卜素家族，是近年來(lái)受到廣泛關(guān)注的新一代強(qiáng)大的抗氧化劑。其抗氧化能力比其他β類(lèi)胡蘿卜素或維生素E的抗氧化能力更高，已經(jīng)有體內(nèi)試驗(yàn)報(bào)道其不僅對(duì)氧化應(yīng)激有很好的保護(hù)作用，而且還能有效地緩解炎癥反應(yīng)[5]。本試驗(yàn)將LPS作為刺激源建立RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，研究蝦青素預(yù)保護(hù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)有何影響，對(duì)蝦青素的抗炎效果進(jìn)行評(píng)估，為今后的炎癥治療及疾病防控方面奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 蝦青素，純度 (w)98%(美國(guó)Sigma公司)、脂多糖和MTT溶液(美國(guó)Sigma公司)、DMSO(北京 Solarbio 公司)、RNA Lyzol(上海ExCell Bio 公司)、First-Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó) GeneCopoeia公司)、ELISA 試劑盒 (上海朗頓生物公司)、引物(上海生工生物公司)、RIPA裂解液(北京Solarbio公司)、BCA法蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)、TLR4抗體、MyD88抗體、NF-кB p65 抗體、β-actin 抗體 (美國(guó) CST 公司)、辣根過(guò)氧化物酶 (Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗鼠/兔抗體(天津三箭公司)、ECL 試劑盒 (美國(guó) Millipore 公司)、RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)。

1.1.2 主要儀器 二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)；倒置相差顯微鏡及全自動(dòng)顯微攝像裝置(日本Olympus公司)；Thermo酶標(biāo)儀(上海賽默飛世爾儀器公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(美國(guó)Branson公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠單核巨噬細(xì)胞系 (RAW264.7)保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。復(fù)蘇凍存的RAW264.7細(xì)胞后，接種到含有雙抗和體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，放在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。間隔1～2 d更換培養(yǎng)液1次，待其貼壁生長(zhǎng)到鋪滿所用培養(yǎng)瓶底面積的80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，然后將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞板中繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 將試驗(yàn)細(xì)胞分為4組，分別為對(duì)照組(CK組)、蝦青素組(AST組)、脂多糖組(LPS組)和蝦青素+脂多糖組(AST+LPS組)。

1.2.3 MTT 法測(cè)定蝦青素對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)使細(xì)胞的密度保持在 1×105個(gè)/mL，每孔 100 μL，隨后放置于 37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。將 5 mg蝦青素溶于 1 mL DMSO 中進(jìn)行稀釋，制成蝦青素溶液，取 0、18、36、72、108、144 μL 的蝦青素溶液分別加入到6 mL的RPMI1640培養(yǎng)液中，使蝦青素終濃度為 0、25、50、100、150、200 μmol/L。加入上述含不同濃度蝦青素的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度梯度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行3、6、12、24、48 h的處理后將培養(yǎng)液棄掉，隨即在每孔中加入1 mg/mL 的 MTT 溶液 100 μL 進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，4 h后棄掉液體并在每孔加入100 μL DMSO，在振蕩器中震蕩5 min以充分混合，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定D490 nm，計(jì)算不同蝦青素濃度組和對(duì)照組D490 nm的比值。根據(jù)不同處理時(shí)間的細(xì)胞活力最高值來(lái)判斷用蝦青素處理RAW264.7細(xì)胞的最佳濃度及處理時(shí)間。

1.2.4 MTT 法測(cè)定脂多糖對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 參照“1.2.3”的步驟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，隨后加入不同質(zhì)量濃度的脂多糖，即0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度設(shè)置5 個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行 3、6、12、24、48 h 的處理后將培養(yǎng)液棄掉，根據(jù)“1.2.3”的操作步驟先后加入MTT及DMSO測(cè)定D490 nm，計(jì)算不同脂多糖濃度組和對(duì)照組的D490 nm比值，并根據(jù)不同處理時(shí)間的細(xì)胞活力最高值來(lái)判斷用脂多糖處理RAW264.7細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度及處理時(shí)間。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子分泌量 采用ELISA檢測(cè)蝦青素作用于脂多糖刺激的細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響，步驟如下：用PBS緩沖液對(duì)最佳條件處理的細(xì)胞進(jìn)行稀釋，使其密度保持在1×106個(gè)/mL。用超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)細(xì)胞反復(fù)進(jìn)行破碎處理后放入高速離心機(jī)中，4 ℃、2 000～3 000 r/min 離心 20 min 并收集上清液。參照ELISA試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，通過(guò)細(xì)胞濃度和D450 nm的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及回歸方程的計(jì)算。

1.2.6 qPCR檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量 采用熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)蝦青素作用于脂多糖刺激的細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量的影響，步驟如下：將最佳條件處理的細(xì)胞取出，根據(jù)RNA Lyzol說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞RNA，并對(duì)樣品進(jìn)行RNA質(zhì)量的檢測(cè)，若D260 nm/D280 nm及D260 nm/D230 nm保持在1.8～2.0的范圍內(nèi)，方可進(jìn)行下一步的試驗(yàn)；按照First-Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成；最后采用qPCR技術(shù)進(jìn)行表達(dá)量的測(cè)定。qPCR 采用 20 μL 的反應(yīng)體系：SYBR Premix 10 μL、上、下游引物各 1 μL、ddH2O 6 μL、cDNA 模板 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性 30 s；95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火 30 s，40 個(gè)循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。每次試驗(yàn)用 18s RNA 作為內(nèi)參，用 2?△△Ct法計(jì)算相關(guān)炎癥因子的相對(duì)表達(dá)量，引物序列如表1所示。

表1 qPCR的引物序列Table 1 qPCR primer sequence

1.2.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子的蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測(cè)蝦青素作用于脂多糖刺激的細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)的影響，步驟如下：取出最佳條件處理的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液進(jìn)行清洗，洗滌1～2次后用RIPA裂解液將細(xì)胞輕輕刮下，放入高速離心機(jī)中，4 ℃、12000 r/min 離心 5 min，用 BCA 法對(duì)收集的上清液進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。用30 μg總蛋白進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用0.05 g/mL脫脂奶粉封閉 1 h，分別以鼠源的 NF-кB p65 抗體(按 1∶1 000 體積比稀釋)、鼠源的β-actin 抗體 (按 1∶5 000體積比稀釋)、兔源TLR4抗體(按1∶500體積比稀釋)和兔源 MyD88抗體 (按 1∶1000體積比稀釋)作為一抗在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。用1×TBST溶液進(jìn)行洗膜后分別加入相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，即山羊抗鼠(按1∶2 000體積比稀釋)和山羊抗兔(按 1∶2 000 體積比稀釋)，并在 37 ℃ 條件下孵育 1 h。繼續(xù)用1×TBST洗膜，感光，最后用顯影液進(jìn)行顯色，目的蛋白量通過(guò)灰度比值來(lái)表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用Duncan’s法對(duì)各處理組進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素和脂多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

2.1.1 蝦青素對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 對(duì)RAW264.7細(xì)胞采用不同濃度梯度的蝦青素進(jìn)行不同時(shí)間的處理，即：0、25、50、100、150、200 μmol/L的蝦青素各作用于細(xì)胞 3、6、12、24、48 h，通過(guò) MTT法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞活力。結(jié)果如圖1所示：隨著濃度的增長(zhǎng)，各處理時(shí)間的細(xì)胞活力總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)；用不同濃度的蝦青素作用RAW264.7 細(xì)胞 3、6、12 h 后，可以增強(qiáng)細(xì)胞活力，與 0 μmol/L AST 組相比，當(dāng)濃度在 25、50、100、150 μmol/L 且作用 3 h后，可以顯著增強(qiáng)細(xì)胞活力(P<0.05)，在濃度為 100 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力達(dá)到峰值；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦青素濃度越高，細(xì)胞的活力會(huì)隨之降低，當(dāng)用200 μmol/L蝦青素作用RAW264.7細(xì)胞48 h后，可以顯著降低細(xì)胞活力(P<0.05)，所以選取作用 3 h、濃度為 100 μmol/L 的蝦青素作為試驗(yàn)的最佳作用條件，在此時(shí)間點(diǎn)和濃度范圍內(nèi)，蝦青素對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 脂多糖對(duì) RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 對(duì) RAW 264.7細(xì)胞采用不同質(zhì)量濃度梯度的脂多糖進(jìn)行不同時(shí)間的處理，即：0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL 的脂多糖各作用于細(xì)胞 3、6、12、24、48 h。通過(guò)MTT法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2所示：在細(xì)胞處理3、6、12 h后，脂多糖可以不同程度地激活RAW264.7細(xì)胞；與0 μg/mL的LPS組相比，當(dāng)質(zhì)量濃度在2.0 μg/mL且處理3 h后，細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)并達(dá)到峰值；隨著時(shí)間和質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL以上且處理48 h后，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)。

綜合圖1、圖2結(jié)果，100 μmol/L的蝦青素和2 μg/mL的脂多糖作用3 h為最佳的處理?xiàng)l件。

2.2 蝦青素對(duì)脂多糖刺激的細(xì)胞中炎癥因子分泌量的影響

采用ELISA法對(duì)炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-6及Caspase-1的分泌量進(jìn)行檢測(cè)，如圖3所示：LPS 組的 TNF-α、IL-1β、IL-6及 Caspase-1的分泌量達(dá)到最高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，而用蝦青素進(jìn)行預(yù)保護(hù)使 TNF-α、IL-1β、IL-6及 Caspase-1的分泌量相對(duì)于LPS組來(lái)說(shuō)有所下降，其中TNF-α、IL-6和Caspase-1的分泌量與LPS組相比分別降低了12.83%、9.66%和20.80%，差異顯著(P<0.05)，而 IL-1β 無(wú)顯著差異 (P>0.05)。

2.3 蝦青素對(duì)脂多糖刺激的細(xì)胞中炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

圖1 不同濃度蝦青素對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of astaxanthin on the viability of RAW264.7 cells at different concentration

圖2 不同質(zhì)量濃度脂多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of different content of lipopolysaccharide on the viability of RAW264.7 cells

圖3 蝦青素預(yù)保護(hù)對(duì)脂多糖刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響Fig.3 Effects of astaxanthin pre-protection on inflammatory factor secretion from RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide

對(duì)炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行量化分析是反映炎癥嚴(yán)重程度的必要措施，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以此來(lái)判斷蝦青素預(yù)保護(hù)是否可以抑制脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子的釋放。由圖4可知：LPS組中TNF-α、IL-1β及IL-18mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高，相較于對(duì)照組呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，蝦青素預(yù)保護(hù)使得炎性因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量發(fā)生顯著降低(P<0.05)；而LPS組中IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，AST+LPS組中其mRNA相對(duì)表達(dá)量有所降低，但與LPS組相比并沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。由此證明蝦青素預(yù)保護(hù)可以有效地抑制炎性因子的表達(dá)。

2.4 蝦青素對(duì)脂多糖刺激的細(xì)胞中炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

圖4 蝦青素預(yù)保護(hù)對(duì)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of astaxanthin pre-protection on mRNA expression of inflammatory factor in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide

通過(guò)Western blot檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-кB p65 的蛋白相對(duì)表達(dá)量，以此來(lái)證明蝦青素是否可以通過(guò)阻止LPS與其Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合來(lái)減少促炎信號(hào)的傳導(dǎo)以緩解LPS造成的炎癥。結(jié)果如圖5、圖6所示：LPS組與對(duì)照組相比，TLR4、MyD88、NF-кB p65 的蛋白相對(duì)表達(dá)量都有不同程度的提高，其中TLR4和NF-кB p65蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別升高了195.40%和226.95%(P<0.05)，MyD88的蛋白相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05);而 AST+LPS 組中，TLR4、MyD88和 NF-кB p65的蛋白相對(duì)表達(dá)量較LPS組分別降低了54.99%、45.70%和28.20%(P<0.05)。綜合結(jié)果顯示，蝦青素的添加可以降低 TLR4、MyD88、NF-кB p65的蛋白表達(dá)水平。

圖5 蝦青素預(yù)保護(hù)下脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子蛋白的電泳圖Fig.5 Electrophoresis of inflammatory factor in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide under astaxanthin pre-protection

圖6 蝦青素預(yù)保護(hù)對(duì)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞中炎癥因子蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of astaxanthin pre-protection on relative protein expression of inflammatory factor in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide

3 討論與結(jié)論

炎癥是病原體、受損細(xì)胞或刺激物靶向的基本防御機(jī)制。炎癥反應(yīng)可用于宿主防御、組織修復(fù)反應(yīng)和穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)等多種生理目的。然而，這種反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生病理學(xué)后果，導(dǎo)致炎癥性組織損傷，化生和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變。因此，身體需要適當(dāng)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[6]。

細(xì)胞因子發(fā)揮著廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)人體生物學(xué)和疾病至關(guān)重要。細(xì)胞因子分為促炎因子和抑炎因子，二者通過(guò)動(dòng)態(tài)平衡維持著機(jī)體的健康。促炎性細(xì)胞因子增多往往會(huì)引起發(fā)燒、發(fā)炎、組織破壞或全身性發(fā)炎，從而使疾病惡化。TNF-α是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，LPS是較強(qiáng)的刺激劑[7-9]。IL-1是一種重要的促炎細(xì)胞因子，能夠激活多種免疫和炎癥細(xì)胞，包括IL-lα和IL-1β，主要由巨噬細(xì)胞分泌，并且像TNF-α一樣充當(dāng)“報(bào)警細(xì)胞因子”[8]。TNF-α及IL-1被認(rèn)為是“早期反應(yīng)”細(xì)胞因子，這意味著它們?cè)诿庖邞?yīng)答的最早階段被釋放，并作為隨后的促炎性細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)性的觸發(fā)。IL-1β能夠通過(guò)自分泌或者旁分泌刺激其他細(xì)胞因子如IL-6的釋放和炎癥因子的產(chǎn)生[9]。IL-6是一種關(guān)鍵的多效性炎癥細(xì)胞因子，既可以作為促炎性細(xì)胞因子，又可作為抗炎性細(xì)胞因子，在誘導(dǎo)下游炎癥反應(yīng)中起重要作用。在某種程度上，它起著防御的作用。但是，在一些炎癥性疾病中，它是促炎性的[10]。半胱氨酸蛋白酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中的作用是眾所周知的，而其家族的某些成員的主要作用是調(diào)節(jié)炎癥，其中Caspase-1是小鼠中的促炎性半胱氨酸蛋白酶，主要催化促炎細(xì)胞因子Pro-IL-1β和Pro-IL-18在細(xì)胞內(nèi)加工為成熟IL-1β和IL-18[11]。IL-18通過(guò)自分泌的方式促進(jìn)一系列化合物和酶的產(chǎn)生，如IL-6、IL-18、iNOS等[12]。從本試驗(yàn)研究結(jié)果中可以看出，與對(duì)照組相比，TNF-α、IL-1β、IL-6 及 Caspase-1 作為促炎因子在用2 μg/mL的LPS給予RAW264.7細(xì)胞3 h刺激后分泌量或表達(dá)量有顯著性升高，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞處于炎癥的狀態(tài)，當(dāng)用100 μmol/L的蝦青素預(yù)保護(hù)3 h再給予刺激時(shí)，相較于LPS組，相關(guān)促炎因子的分泌量或表達(dá)量相較于LPS組顯著下降，其中TNF-α、IL-1β和caspase-1分泌量分別降低了12.83%、9.66%和20.80%，這說(shuō)明蝦青素預(yù)保護(hù)可以一定程度地緩解LPS對(duì)RAW264.7刺激帶來(lái)的炎癥反應(yīng)。

TLR在通過(guò)感應(yīng)微生物對(duì)入侵病原體的早期先天免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，并參與感應(yīng)內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)。而脂多糖作為細(xì)菌細(xì)胞壁的組成部分，可以有效激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。在免疫細(xì)胞中，TLR4作為T(mén)LR中主要的脂多糖識(shí)別的受體，嚴(yán)格調(diào)控炎癥反應(yīng)，可以避免LPS刺激所引起的組織損傷以及各種細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生[13]。當(dāng)免疫細(xì)胞被激活后，TLR4會(huì)與包含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白，如MyD88結(jié)合[14]。MyD88是TLR4必需的銜接子分子，當(dāng)受到LPS刺激時(shí)，TLR4會(huì)與MyD88結(jié)合形成TLR4-MyD88復(fù)合物，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的激活，主要是NF-κB和有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)[15-18]。NF-κB是先天免疫，應(yīng)激反應(yīng)和炎癥的重要轉(zhuǎn)錄因子[19]，其激活使NF-кB p65亞基從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄原件相結(jié)合，誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[16]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)細(xì)胞中 TLR4、MyD88、NF-кB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果顯示，LPS組中，細(xì)胞的各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)相較于對(duì)照組均有所上升且TLR4和NF-кB p65的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別升高了195.40%和226.95%，但MyD88的蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異；相較于LPS組，蝦青素預(yù)保護(hù)組中TLR4、MyD88及NF-кB p65的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別下降了54.99%、45.70%和28.20%。由此推測(cè)蝦青素可能能夠負(fù)性調(diào)控TLR4介導(dǎo)的通路之一，即TLR4/MyD88/NF-кB通路，來(lái)減少炎癥因子的釋放，從而達(dá)到緩解炎癥的目的。

綜上所述，蝦青素可以作為一種外源性抗炎的添加物。蝦青素預(yù)保護(hù)可以不同程度地減少脂多糖誘導(dǎo)的炎癥因子的分泌量及表達(dá)量，降低TLR4、MyD88、NF-кB p65 蛋白的表達(dá)來(lái)緩解炎癥反應(yīng)，此結(jié)果的產(chǎn)生與TLR4/MyD88/NF-кB通路密切相關(guān)。