邱 城，劉青海，張飛龍，李繼榮，張?zhí)苽ィ瑓茄┥?，潘崇雙，黃利英

(西藏自治區(qū)農牧科學院 農業(yè)質量標準與檢測研究所，西藏 拉薩 850032)

西藏位于中國青藏高原西南部，素有“世界屋脊”之稱，生活在這里的人們將奶渣、酥油茶、甜茶和酸奶等以乳為原料制作的食物作為主食已有上千年乃至更長的歷史。西藏地區(qū)氣候條件較為惡劣，但卻具有豐富的奶資源，牧區(qū)主要以牦牛奶為主。同時隨著與外界交流的加深，奶牛的引入以及羊奶資源的增加，其奶制品也成為人們不可缺少的主要食品之一。當地傳統(tǒng)的發(fā)酵奶制品種類繁多，主要有酸奶、曲拉、牛乳、干酪、酥油、奶渣、黃油等?！把╊D節(jié)”即“酸奶節(jié)”在拉薩河流域已經成為地位僅次于藏歷新年的第2大節(jié)日[1]。藏區(qū)牧民制作酸奶的方法古老而傳統(tǒng)：首先將鮮奶煮沸，冷卻至室溫，然后接種上次制作時留存下來的酸奶，再使用傳統(tǒng)木桶充分攪打將其混勻，最后置于室內較為暖和的地方(約25～30 ℃)過夜發(fā)酵[2]。隨著酸奶消費市場需求的逐漸增大，酸奶的生產也由單一的傳統(tǒng)的農牧民自產方式轉變?yōu)槊耖g小作坊、企業(yè)產業(yè)化生產等方式共存的多種生產方式。但由于西藏交通不便、信息閉塞等各方面原因，西藏的乳業(yè)起步較晚、基礎較差，生產技術水平相對較為滯后，在很長一段時間里發(fā)展極為緩慢。

環(huán)境中的重金屬(如鉛、砷、鎘、鉻等)會通過食物鏈的遷移在人體中沉積，給人體健康帶來極大的威脅，重金屬可通過食物、水、空氣進入人體后與蛋白質及各種酶作用，使其失去活性，也可在人體臟器中富集，對人體造成急性、亞急性、慢性中毒[3]。美國環(huán)保局已在1979年將包括鉛、砷、鎘、鉻等13種元素在內的重金屬及其化合物列入污染物名單，建議對這些能夠對人體健康產生危害的污染物進行重點監(jiān)控，我國也制定了針對污染物控制的國家標準，將鉛、砷、鎘、鉻等污染物在各種食品中的限量作為控制危害的有效指標列入其中[4-5]。黃曲霉毒素是迄今發(fā)現的最毒的物質之一，其毒性是氰化鉀的27倍，屬于第1類強致癌物，黃曲霉毒素是由黃曲霉Aspergillus flavus或寄生曲霉A.parasiticus分泌的一系列毒素，主要有6種結構類似物，分別是 M1、M2、B1、B2、G1 和 G2，而在牛奶和酸奶中主要以黃曲霉毒素M1的形式存在[6-10]。酸奶中微生物種類和含量直接影響酸奶的營養(yǎng)價值及其在人體腸道中的功能性作用，隨著收入和生活水平的不斷提高，消費者對酸奶的認知不只停留在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的范疇，也開始關注酸奶本身的營養(yǎng)價值和酸奶發(fā)酵菌種的生物特性[11-12]。

近年來，由于三聚氰胺等乳品安全事件的影響，人們提高了對乳品安全的關注度，企業(yè)也加快了上游奶源地建設的產業(yè)鏈延伸，西藏乳業(yè)的發(fā)展開始逐漸受到人們的重視，并逐漸有了起色。本研究主要是在對拉薩酸奶中有毒有害殘留物(重金屬、黃曲霉毒素M1、微生物)風險隱患摸底排查的基礎上，進行過程驗證評價和終端定量評價，從而對酸奶中有毒有害殘留物污染狀況進行評估分析，為提高拉薩酸奶質量安全水平、強化質量安全監(jiān)管提供強有力科技數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酸奶來源 從拉薩林周縣、城關區(qū)、墨竹工卡縣和當雄縣采集農牧民自家生產以及企業(yè)和小作坊生產的酸奶樣品106個(每個樣品取3～4份，共計418份)，其中：按地域計，林周縣采樣22個，城關區(qū)采樣40個，墨竹工卡縣采樣23個，當雄縣采樣21個；按生產模式計，企業(yè)采樣8個，小作坊采樣54個，家庭自產采樣44個。采樣點分布示意圖見圖1。

圖1 西藏4縣(區(qū))酸奶采樣點分布示意圖Fig.1 Distribution diagram of yogurt sampling points in four counties (districts)of Tibet

1.1.2 試劑及藥品 硝酸、鹽酸和氫氧化鉀 (均為優(yōu)級純，成都市科龍化工試劑廠生產)，高氯酸(優(yōu)級純，天津市鑫源化工有限公司生產)，甲醇(色譜純，Fisher Chemical生產)，乙酸銨 (色譜純，DikmaPure生產)；汞、鉛、鎘、鉻、砷各元素標準溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心生產)；孟加拉紅培養(yǎng)基及 LST、VRBA、BGLG、PCA、BPW、SC、XLT4 Agar、Baird-Parker、BHI、XLD、MAC培養(yǎng)基(均為北京陸橋技術股份有限公司生產)；黃曲霉毒素M1標準品(廣州中實生物科技有限公司生產)。

1.2 儀器與設備

NEXION 350X型三重四級桿電感耦合等離子體質譜儀(美國PerkinElmer科技有限公司生產)；AB204型電子天平(瑞士Mettler公司生產)；Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司生產)；AB5500 HPLC-MS(美國 AB 公司生產)；OLYMPUS BH-2 顯微鏡(日本OLYMPUS公司生產)。

1.3 檢測方法

1.3.1 微生物檢測 大腸菌群、菌落總數、霉菌與酵母菌Saccharomyce、沙門氏菌Salmonella、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和志賀氏菌Shigella，參照《GB/T4789—2016》[13]方法規(guī)定，以平板計數法評估檢驗。菌落總數是指食品檢樣經過處理，在一定條件下(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質等)培養(yǎng)后，每克(或每毫升)檢樣中形成的微生物菌落總數。菌落總數主要作為判定食品被污染程度的指標，我國食品中菌落總數限量值為 2×106cfu/g 或 2×106cfu/mL。

1.3.2 毒素檢測 黃曲霉毒素 M1 參照《GB/T 5009.24—2016》[14]規(guī)定的方法檢驗：稱取 4 g 混合均勻的試樣(精確到0.001 g)于50 mL離心管中，加入 100 μL13C17-AFT M1 內標溶液 (5 ng/mL)震蕩混勻后靜置 30 min，加入 10 mL 甲醇，渦旋 3 min。置于 4 ℃ 條件下、6000 r/min 離心 10 min 或經玻璃纖維濾紙過濾，將適量上清液或濾液轉移至燒杯中，加入40 mL水或PBS稀釋，上機測定。

1.3.3 重金屬檢測 試驗條件：等離子體功率1 550 W；蠕動泵采集轉速 0.1 r/s；蠕動泵快速提升轉速 48 r/min；蠕動泵快速提升時間 30 s；輔助氣體流速 1.0 L/min；載氣流速 1.07 L/min；采樣深度 8.2 mm；霧化室溫度 2 ℃；氦氣流速 5.0 mL/min。

標準溶液的配制：精密量取 1000μg/mL 的 Hg、Pb、As、Cd、Cr各元素標準溶液，用體積分數為1%硝酸溶液稀釋成1 μg/mL的標準儲備液。用Hg 標準儲備液制成 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 μg/L的標準系列溶液；用Pb標準儲備液制成0、10、20、30、40和 50 μg/L的標準系列溶液；用As和 Cd標準儲備液分別制成 0、2、4、6、8 和 10 μg/L 的標準系列溶液；用Cr標準儲備液制成 0、10、20、30和40 μg/L的標準系列溶液，避光保存于4 ℃冰箱中備用。

樣品前處理：分別準確稱取酸奶樣品1 g(精確到 0.0001g)，置于錐形瓶中，在通風櫥中加入 9 mL硝酸和1 mL高氯酸，放置過夜，次日于電熱板上消解。消解至溶液澄清無色(如未澄清，需加消解液繼續(xù)消解)，冒高氯酸白煙，錐形瓶中剩余液體體積為0.5～1.0 mL左右為止。再加入2.5 mL濃鹽酸繼續(xù)加熱至冒高氯酸白煙，取下冷卻，轉移至25 mL容量瓶中，用體積分數為1%的硝酸溶液定容至刻度。按照同樣的方法處理質控樣，同時做空白試驗[15-18]。

1.4 評價標準及方法

評價標準按照《GB2762—2017食品安全國家標準食品中污染物限量》[19]規(guī)定的乳及乳制品污染物限量標準執(zhí)行，酸奶中重金屬Cr、Pb、Hg和As限量標準分別為 0.30、0.05、0.01 和 0.10 mg/kg。目前，酸奶中Cd的含量并沒有國家限量標準，因此本文未作超標評價。

單因子污染指數法：單因子污染指數適用于單因子污染特定區(qū)域的評價，是以實際污染水平與標準限量值相比較的評價方法。指數的大小直接反映了單因子的污染程度，污染指數越大，表示所受污染越嚴重。單因子污染指數計算公式：

式中：Pi為重金屬污染物i元素的單因子污染指數；Ci為重金屬污染物i元素的實測質量分數，μg/kg；Si為重金屬污染物i元素的限量值，μg/kg。

內梅羅(Nemerow)綜合污染指數：內梅羅綜合污染指數是一種兼顧單因子污染指數平均值和極值的計權型多因子質量指數，反映了各污染物對產品的綜合污染水平，重點突出了高濃度污染物對產品質量的影響。內梅羅綜合污染指數(Pn)計算公式：

式中：(Ci/Si)2ave為所有污染物單因子污染指數的平均值；(Ci/Si)max為所有評價污染物中單因子污染指數的最大值。

污染物貢獻率：污染物貢獻率反映各單因子污染物主次順序，可確定主要污染物項目，其計算公式為：

式中：Ki為產品重金屬污染物i元素所占的貢獻率；P為各重金屬污染物單因子污染指數之和。

分級標準：按照農業(yè)行業(yè)標準《NY/T 398—2000農、畜、水產品污染監(jiān)測技術規(guī)范》[20]制定的農、畜、水產品中質量分級標準，將乳制品污染劃分為3個質量等級進行評價，綜合污染指數亦按單因子污染指數質量分級標準進行評價[21-23]，具體見表1。

在被監(jiān)測乳制品中若同時存在多種污染物時，按該乳制品中污染物最高質量分級數來確定乳制品的質量分級，即以最高限制因素計算污染指數。

表1 乳制品質量分級標準Table 1 Quality grading standards for dairy products

1.5 數據處理

文中數據采用Excel 2017和SPSS17.0進行統(tǒng)計及方差分析和Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 酸奶中重金屬污染狀況分析

拉薩城關區(qū)、林周縣、墨竹工卡縣和當雄縣4個縣(區(qū))的酸奶中重金屬檢出情況列于表2。由表2可知，4個縣(區(qū))的抽樣酸奶中，重金屬總體檢出率：As(50.0%)>Cd(33.0%)>Cr(26.4%)>Pb(23.6%)>Hg(0.9%)；重金屬超標率：Pb(11.3%)=Cr(11.3%)>As(0.9%)>Hg(0%)，當雄縣酸奶中Cr含量超標率較其他三地高，城關區(qū)酸奶中Pb、As含量超標率較其他三地高；4個縣(區(qū))總體來看，抽樣酸奶中重金屬污染的平均貢獻率Pb(42.51%)>Cr(33.49%)>As(16.26%)>Hg(7.74%)。不同區(qū)域生產酸奶中污染指數及綜合污染指數評價結果顯示，當雄縣酸奶中的重金屬污染物單因子污染指數以Cr最高(PCr=0.688)，按照乳制品質量分級標準進行評價，屬輕度污染。

表3顯示了3種模式（小作坊、農牧民家庭和企業(yè)）生產酸奶中重金屬的檢出情況：小作坊生產酸奶中重金屬Pb、Cr、As、Hg含量水平較農牧民家庭和企業(yè)生產酸奶變幅大；小作坊生產酸奶中Pb、Cr含量超標率較農牧民家庭高，分別達14.8%和13.0%，企業(yè)產酸奶中未發(fā)現重金屬Cr、Pb、Hg和As超標情況；家庭自產和小作坊產酸奶中Pb和Cr均有不同程度的超標。

表2 不同區(qū)域生產酸奶中重金屬檢出情況Table 2 Detectionstatus of heavy metals in yogurt produced in different regions

表3 不同模式生產酸奶中重金屬檢出情況Table 3 Detectionstatus of heavy metals in yogurt produced by different modes

對來自不同生產區(qū)域(林周縣、城關區(qū)、墨竹工卡縣和當雄縣)和不同生產模式(家庭自產、企業(yè)和小作坊)酸奶中檢出重金屬Cd、Cr、Pb和As的樣品進行單因素方差分析，結果(表4和表5)顯示，拉薩地區(qū)不同區(qū)域和不同生產模式生產的酸奶中檢出的重金屬含量差異不顯著。

使用SPSS17.0 Pearson對酸奶中各重金屬做相關性分析，結果顯示，酸奶中重金屬Cr的含量與重金屬As含量呈顯著正相關(表6)。

表4 不同區(qū)域生產酸奶中重金屬含量單因素方差分析Table 4 One-way analysis of variance of heavy metal content in yogurt produced in different regions

表5 不同模式生產酸奶中重金屬含量單因素方差分析Table 5 One-way analysis of variance of heavy metal content in yogurt produced by different production modes

表6 酸奶中重金屬含量相關性分析1)Table 6 Correlation analysis of heavy metal content in yogurt

2.2 酸奶中微生物污染狀況分析

我國食品中菌落總數限量值為2×106cfu/g(或2×106cfu/mL)[13]。經檢測，拉薩地區(qū)酸奶樣品僅有2個樣品的菌落總數超過國家限量值，其菌落總數分別為 23.3×106和 28.1×106cfu/g，這 2 個樣品分別為城關區(qū)酸奶企業(yè)和當雄縣的小作坊生產。由表7可知，城關區(qū)和當雄縣酸奶中菌落總數超標率較低，分別為2.5%和4.8%，說明拉薩地區(qū)酸奶中菌落總數的污染基本可控，對其質量安全的影響不大。

對采集的拉薩地區(qū)3種生產模式加工的酸奶樣品進行大腸菌群的檢測，結果(表8)顯示：家庭自產酸奶的大腸菌群超標率為6.82%，高于小作坊生產的酸奶；企業(yè)生產的酸奶大腸菌群超標率為0。結合菌落總數超標的樣品情況(表7)綜合判斷，企業(yè)生產酸奶的衛(wèi)生質量狀況較好，沒有感染大腸菌群。從表7、表8中還可以看出：拉薩地區(qū)酸奶中霉菌污染嚴重，霉菌超標率平均為46.23%，墨竹工卡縣霉菌超標率最高，小作坊生產的酸奶霉菌超標率最低；小作坊生產的酸奶中金黃色葡萄球菌檢出率最高，為25.93%。拉薩地區(qū)酸奶中的志賀氏菌和沙門氏菌均未檢出，但是由于樣本量較少，不足以說明拉薩地區(qū)酸奶中不存在志賀氏菌和沙門氏菌污染的情況。

表7 不同區(qū)域生產酸奶中微生物狀況分析Table 7 Analyses of microorganisms in yogurt produced in different regions

表8 不同模式生產酸奶中微生物狀況分析Table 8 Analysis of microorganisms in yogurt with different production modes

2.3 酸奶中黃曲霉毒素污染狀況分析

對采集于拉薩地區(qū)的106個酸奶樣品進行黃曲霉毒素M1檢測，結果顯示，拉薩地區(qū)106個酸奶樣品均未檢出黃曲霉毒素M1，表明拉薩地區(qū)生產的酸奶沒有感染強致癌物黃曲霉毒素M1。

3 討論與結論

西藏地區(qū)酸奶生產中重金屬、微生物等污染物的污染過程非常復雜，本研究通過對拉薩4縣(區(qū))3種不同生產模式生產的酸奶進行調查取樣，在對酸奶中重金屬、微生物以及黃曲霉毒素M1等有毒有害殘留物分析測定的基礎上，同時對酸奶中不同污染物的污染特征、累計規(guī)律及相關性進行了研究。

拉薩4縣(區(qū))中，當雄縣酸奶中的重金屬Cr含量顯著高于其他三地，是該地區(qū)酸奶的主要金屬污染物；城關區(qū)酸奶中Pb、As含量超標率較其他三地高；林周縣、城關區(qū)、墨竹工卡縣生產酸奶中，Pb是主要重金屬污染物。3種模式生產的酸奶中，Pb是主要重金屬污染物，并且重金屬Cr與As之間存在顯著正相關性。有研究發(fā)現，酸奶中的重金屬殘留主要來源于飼料、飲水以及奶畜服用中草藥而引起[24]。

對拉薩4縣(區(qū))酸奶中微生物的檢測發(fā)現，霉菌污染嚴重，平均超標率為46.23%，墨竹工卡縣霉菌超標率最高，小作坊生產酸奶的霉菌污染率最低；城關區(qū)小作坊生產的酸奶中金黃色葡萄球菌檢出率最高。我國飼料原料中霉菌毒素污染現象也比較普遍[25]，已經成為我國牛奶質量安全的重要風險因子之一。因此，準確分析其污染特征也可以有效預防奶及奶制品中霉菌毒素污染事件的發(fā)生，有利于提升我國牛奶及奶產品質量安全[26-27]。拉薩地區(qū)酸奶中未檢出黃曲霉毒素M1，可能是飼養(yǎng)奶牛的飼料沒有產生黃曲霉毒素的緣故。牛奶中的霉菌毒素通常也來源于飼料，西藏地區(qū)特殊的自然環(huán)境不容易使飼料發(fā)霉并產生黃曲霉毒素，但是由于酸奶的發(fā)酵與罐裝等生產過程均不是在完全封閉的情況下進行，因此從酸奶原料的選取到生產過程中設備操作、產品包裝以及最后酸奶產品的貯藏與銷售等各個環(huán)節(jié)，環(huán)境中都存在較多的霉菌、酵母菌等，使得酸奶生產加工中又相對容易出現微生物污染[28]。因此，這些生產環(huán)節(jié)都是需要改進的。酸奶中志賀氏菌、沙門氏菌未被檢出，推測是由于樣本數量較少和取樣地局限性造成的，在后續(xù)研究中需擴大樣本選取范圍和數量，以充分反映該地區(qū)酸奶中2種微生物的污染狀況。

本研究在對拉薩地區(qū)(城關區(qū)、墨竹工卡縣、林周縣和當雄縣)酸奶的質量安全現狀進行調查摸底的同時，結合《GB 2762—2017食品安全國家標準食品中污染物限量》[19]和農業(yè)行業(yè)標準《NY/T 398—2000農、畜、水產品污染監(jiān)測技術規(guī)范》[20]對酸奶質量安全進行風險評估分析。針對西藏地區(qū)酸奶中重金屬和霉菌污染狀況，應當從生產原料、生產過程以及貯藏流通等方面加以重視，采取相應的措施進行治理。加強飼料等原料霉菌污染預防控制；改善生產環(huán)境和加強生產人員的規(guī)范化操作；加強生鮮乳中微生物以及有毒有害物質的控制；加大奶畜養(yǎng)殖方面法律法規(guī)的宣傳培訓力度，通過實施各項舉措提高拉薩酸奶食品質量安全水平。本研究為強化酸奶質量安全監(jiān)管提供了強有力的科技數據支撐，為進一步促進拉薩地區(qū)農牧業(yè)增效、農牧民增收，發(fā)揮西藏特色產品應有的價值提供了保障。