鄺燕齊，莫梅君，何紅玲，周金柱，周如月，郭霄峰

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014)

豬流行性腹瀉 (Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種高度接觸性豬腸道傳染疾病。PEDV主要引起10日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病，典型的癥狀為水樣腹瀉、脫水、嘔吐等。自1971年英國(guó)首次報(bào)道PED后，該病已在世界各地流行[1-4]。2011年以來(lái)，我國(guó)多個(gè)地區(qū)暴發(fā)了PEDV變異毒株引起的PED[5-8]，新生仔豬發(fā)病率和死亡率高達(dá)90%以上，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[9-10]。

PEDV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬的成員，主要結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突 (Spike，S)蛋白、膜 (Membrane，M)蛋白、包膜(Envelope，E)蛋白和核衣殼 (Nucleocapsid，N)蛋白[11]。每種蛋白都在病毒的繁殖中發(fā)揮重要作用。N蛋白高度保守，在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大[12-13]，也是病毒復(fù)制過(guò)程中表達(dá)量最大的一種堿性結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫至關(guān)重要。與S蛋白一樣，N蛋白也是早期準(zhǔn)確檢測(cè)PEDV感染的靶蛋白[14-15]。N蛋白還是一種重要的抗原，在病毒感染機(jī)體的早期刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量抗N蛋白抗體，普遍用于針對(duì)PEDV的血清學(xué)檢測(cè)。

本研究基于N蛋白的特點(diǎn)，以原核表達(dá)的方法制備重組N蛋白，制備抗N蛋白單克隆抗體，并使用該抗體建立PEDV間接免疫熒光試驗(yàn)的抗體檢測(cè)方法，為PEDV的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及PEDV在感染細(xì)胞中的定位和動(dòng)態(tài)分布研究提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 菌種、毒株、細(xì)胞系

原核表達(dá)載體pET-32a(+)，PEDV(CH/GDZH02/1401，簡(jiǎn)稱ZH02)，豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PPRV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、Vero 細(xì)胞、PEDV 抗體均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、豬腸道α冠狀病毒(Porcine enteric α corone virus，PEAV)、豬輪狀病毒 (Porcine rotavirus，PoRV)分別由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)琚春梅博士、馬靜云教授和江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所何孔旺研究員惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

50×HAT(次黃嘌呤?氨甲碟呤?胸腺嘧啶核苷)、HT(次黃嘌呤?胸腺嘧啶核苷)、弗氏佐劑和弗氏不完全佐劑均為Sigma公司產(chǎn)品。HRP?羊抗鼠IgG為碧云天公司產(chǎn)品。FITC?羊抗鼠IgG為博奧森公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF BALB/c 6～8周齡雌性小鼠購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 PEDV N蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定

根據(jù)ZH02毒株(GenBank注冊(cè)號(hào)為KR 153326)基因組序列，設(shè)計(jì) 1 對(duì)引物：PEDV-N-F：5′-CGGCATATGATGGCTTCTGTCAGTTTTCA-3′，PEDV-N-R：5′-CCGCTCGAGATTTCCTGTGTCG AAGATCTC-3′。提取病毒RNA，以PEDV-N-F和PEDV-N-R為引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增 N 基因，與pET-32(a)連接，構(gòu)建PEDV N 基因重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET-N。將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Transetta(DE3)進(jìn)行N蛋白的表達(dá)和純化，隨后將純化好的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

1.5 動(dòng)物免疫

6只8周齡雌性BALB/c小鼠飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。300 μg的PEDV N蛋白與等體積(500 μL)弗氏完全佐劑一起乳化制備免疫原，皮下注射小鼠。一次免疫后第15天和第29天，用等體積（500 μL）弗氏不完全佐劑乳化 300 μg 抗原分別進(jìn)行二次免疫和三次免疫。三次免疫后第10天檢測(cè)小鼠抗N蛋白抗體效價(jià)，當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1∶100 000 后，于融合前 3 d 腹腔注射非乳化抗原 150 μg加強(qiáng)免疫一次。

1.6 抗體滴度的測(cè)定

在96孔酶標(biāo)反應(yīng)板中，每孔加入100 μL純化后的 N 蛋白 (ρ為 8 μg/mL)，37 ℃ 條件下溫育 1 h，然后4 ℃條件下過(guò)夜。棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌3次。每孔加入100 μL封閉液，37 ℃恒溫箱中封閉2 h。棄去封閉液，用PBST緩沖液洗滌3次，加入用PBS緩沖液倍比稀釋的血清或細(xì)胞上清液，置于37 ℃條件下溫育70 min。棄去孵育液，用 PBST 緩沖液洗滌 3 次，加入 100 μL HRP?羊抗鼠IgG(用PBS緩沖液按體積比1∶10 000稀釋)的二抗，置于37 ℃條件下溫育40 min。棄去孵育液，用PBST緩沖液洗滌3次，加入100 μLTMB底物，37 ℃恒溫箱避光顯色5～10 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm，計(jì)算抗體滴度。

1.7 雜交瘤細(xì)胞的篩選

以聚乙二醇(PEG)1450為融合劑將獲得的陽(yáng)性小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，融合后第10天按照“1.6”的方法檢測(cè)細(xì)胞上清液，篩選抗體呈陽(yáng)性細(xì)胞孔。之后對(duì)陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，每亞克隆1次需要對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，直到獲得單個(gè)雜交瘤細(xì)胞株。亞克隆成功后，將雜交瘤細(xì)胞株置于液氮中保存。

1.8 單克隆抗體的制備、檢測(cè)和鑒定

1.8.1 制備 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、抗體分泌能力強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞株通過(guò)體內(nèi)誘生法制備腹水。將弗氏不完全佐劑按每只500 μL的劑量腹腔注射雌性BALB/c小鼠，致敏7 d備用。從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中吹下雜交瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，用1640培養(yǎng)液洗滌2～3次后腹腔注射經(jīng)弗氏不完全佐劑致敏的小鼠。10～15 d后，小鼠腹部明顯膨大時(shí)抽取腹水，經(jīng)4 000 r/min 離心 20 min，收集上清液，ELISA 測(cè)定抗體效價(jià)后分裝凍存于?80 ℃。

1.8.2 單克隆抗體的特異性檢測(cè) 為驗(yàn)證獲得的單克隆抗體的特異性，以TGEV、PPRV、CSFV、PRRSV為抗原包被酶標(biāo)板，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。

1.8.3 單克隆抗體的 Western blot鑒定 將表達(dá)的N蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再將膜放入50 g/L脫脂牛乳溶液中封閉，置于37 ℃條件下孵育2 h；使用PBST緩沖液洗滌4次，將制備的腹水用PBS緩沖液按體積比1∶5 000稀釋作為一抗，置于4 ℃條件下過(guò)夜孵育；使用PBST緩沖液洗滌4次，HRP?羊抗鼠IgG用PBS緩沖液按體積比1∶5 000稀釋后作為二抗，置于37 ℃條件下中孵育1 h；使用PBST緩沖液洗滌4次，加入DAB顯色。

1.9 間接免疫熒光試驗(yàn)

1.9.1 試驗(yàn)方法的建立 待96孔板的Vero細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，接種PEDV。20 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL 預(yù)冷的 80%(φ)丙酮溶液，?20 ℃ 條件下固定30 min。隨后每孔用滅菌的PBS緩沖液洗滌3次，再于每孔加入50 μL用PBS緩沖液稀釋的一抗N蛋白單克隆抗體（N蛋白單克隆抗體與PBS緩沖液的體積比為1∶200），37 ℃條件下孵育2 h。用滅菌的PBS緩沖液洗滌3次，每孔加入50 μL用PBS緩沖液稀釋的二抗FITC?羊抗鼠IgG（FITC?羊抗鼠IgG與PBS緩沖液的體積比為1∶ 100），在 37 ℃ 條件下孵育 1 h。用滅菌的 PBS緩沖液洗滌3次，最后每孔加入100 μL滅菌的PBS緩沖液，置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.9.2 試驗(yàn)方法的優(yōu)化 本試驗(yàn)主要對(duì)一抗工作濃度、二抗工作濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。一抗工作濃度：分別按體積比 1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000 稀釋；二抗工作濃度：分別按體積比 1∶100、1∶200、1∶500、1∶800 稀釋；一抗孵育時(shí)間：4 ℃條件下過(guò)夜孵育、37 ℃條件下孵育2 h。鏡檢觀察結(jié)果。

1.9.3 特異性試驗(yàn) 在長(zhǎng)成單層的Vero細(xì)胞中分別接種 CSFV、PRRSV、TGEV、PPRV、PEAV、PoRV和PEDV，同時(shí)設(shè)立不接病毒的正常細(xì)胞為對(duì)照。接種24 h后，用“1.12”建立的間接免疫熒光方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.9.4 無(wú)一抗對(duì)照試驗(yàn) 用PBS緩沖液替代一抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，觀察二抗是否有特異性反應(yīng)，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照。

1.9.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次和不同批次的Vero細(xì)胞接種病毒，按“1.9.2”建立的間接免疫熒光方法進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)本方法是否具有重復(fù)性。

1.9.6 樣品自發(fā)光對(duì)照試驗(yàn) 將未接種病毒的細(xì)胞板和接種病毒的細(xì)胞板棄去培養(yǎng)基后，每孔加入100 μL滅菌的PBS緩沖液，然后置于熒光顯微鏡下觀察是否存在自發(fā)熒光現(xiàn)象，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。1.9.7 敏感性試驗(yàn) 將PEDV病毒液用不完全培養(yǎng)基DMEM 按照10倍倍比梯度(1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000、1∶1 000 000)進(jìn)行稀釋，按照“1.9.2”建立的間接免疫熒光試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，以出現(xiàn)明顯熒光的最大稀釋倍數(shù)的病毒稀釋度作為檢測(cè)的最高靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV N蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的PEDV核酸為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增 N 基因，再插入pET質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒pET-N。再以該重組子菌液為模板，用PEDV-N-F、PEDV-N-R為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段為1 400 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致 (圖 1)。

圖1 N基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of N gene

2.2 PEDV N蛋白的表達(dá)、純化與鑒定

重組質(zhì)粒pET-N轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)宿主菌Transetta(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE分析，重組子pET-N表達(dá)產(chǎn)物中出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為58 000的特異目的蛋白條帶，與預(yù)期大小相符?？蛰d體宿主菌表達(dá)產(chǎn)物無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，未經(jīng)誘導(dǎo)的重組子表達(dá)產(chǎn)物中出現(xiàn)微弱的特異性條帶(圖2)。純化的N蛋白轉(zhuǎn)膜后，以抗PEDV的抗體染色，發(fā)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為58 000的特異性條帶(圖3)。

圖2 PET-N表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of expressed product PET-N

圖3 純化N蛋白的Western blot檢測(cè)Fig.3 Western blot detection of purified N protein

pET-N重組子在優(yōu)化條件下誘導(dǎo)表達(dá)后，目的蛋白經(jīng)重力流Ni柱層析純化，收集不同濃度咪唑洗脫的蛋白液，用透析膜脫鹽處理后進(jìn)行SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色液脫色。結(jié)果(圖4)顯示，純化的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約58 000，且目的蛋白純度較高，根據(jù)結(jié)果選用300 mmol/L咪唑洗脫的蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度為450 μg/mL。

2.3 抗體效價(jià)

小鼠經(jīng)3次免疫后，用間接ELISA測(cè)定各組小鼠的抗體效價(jià)，其中2～5號(hào)小鼠的抗體水平較低，1號(hào)、6號(hào)小鼠的抗體水平較高，且6號(hào)小鼠的ELISA結(jié)果較為穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)圖5。后續(xù)試驗(yàn)選用6號(hào)小鼠進(jìn)行。

經(jīng)過(guò)2次亞克隆，獲得1株分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞，命名為13。收集雜交瘤細(xì)胞上清液，用PBS緩沖液倍比稀釋，用間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液效價(jià)。將雜交瘤細(xì)胞上清液稀釋3 200倍后仍為陽(yáng)性，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖4 經(jīng)不同濃度咪唑洗脫的純化產(chǎn)物的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of purified product eluted by different concentrations of imidazole

圖5 重組PEDV N蛋白免疫小鼠血清中的抗體效價(jià)Fig.5 Antibody titer in serum of mice immunized with recombinant PEDV N protein

圖6 雜交瘤細(xì)胞上清液的抗體效價(jià)Fig.6 Antibody titer of hybridoma cell supernatant

將雜交瘤細(xì)胞13接種小鼠腹腔制備單克隆抗體。抽取腹水并測(cè)定其抗體效價(jià)，制備的PEDV N蛋白單克隆抗體用PBS緩沖液經(jīng)過(guò)1 024 000倍稀釋后仍為陽(yáng)性，證明該單抗抗體水平較高，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 小鼠腹水中單克隆抗體效價(jià)Fig.7 Monoclonal antibody titer in mouse ascites

2.4 特異性檢測(cè)和Western blot 鑒定結(jié)果

單克隆抗體的特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。以TGEV、PPRV、CSFV、PRRSV和PEDV為抗原包被8 μg/mL的純化N蛋白，將腹水用PBS緩沖液按體積比1∶10 000稀釋作為一抗，采用間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，包被不同稀釋比例的TGEV、PPRV、CSFV、PRRSV均呈陰性反應(yīng)，只有PEDV呈陽(yáng)性，各稀釋比例下的D450 nm穩(wěn)定。

將純化的N蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜后，用脫脂牛乳溶液在37 ℃條件下封閉3 h，將收集并處理好的小鼠腹水用PBS緩沖液按照體積比1∶5 000稀釋作為一抗，4 ℃條件下過(guò)夜孵育，HRP?羊抗鼠IgG用PBS 緩沖液按體積比 1∶5 000 稀釋作為二抗，37 ℃孵育 1 h。進(jìn)行 Western blot分析，在相對(duì)分子質(zhì)量為58 000處有明顯的特異性條帶，結(jié)果見(jiàn)圖8。

2.5 最適工價(jià)濃度

N蛋白單克隆抗體最適工作濃度結(jié)果見(jiàn)圖9。在已接種PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入用PBS緩沖液倍比稀釋的N蛋白單克隆抗體、用PBS緩沖液按體積比1∶100稀釋的FITC?羊抗鼠IgG，同時(shí)設(shè)陰性及空白對(duì)照，然后在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，陰性血清及空白對(duì)照均無(wú)肉眼可見(jiàn)的特異性熒光，N蛋白單克隆抗體在稀釋比例為1∶1 000時(shí)熒光班點(diǎn)最清晰。

在已接種PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)板中加入用PBS緩沖液倍比稀釋的FITC?羊抗鼠IgG和用PBS緩沖液按體積比1∶1 000稀釋的N蛋白單抗，同時(shí)設(shè)樣本自發(fā)熒光對(duì)照及陰性對(duì)照，在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，樣品自發(fā)熒光對(duì)照及陰性對(duì)照均無(wú)肉眼可見(jiàn)的特異性熒光，而FITC?羊抗鼠IgG的稀釋度在1∶100時(shí)熒光斑點(diǎn)最清晰(圖10)。

表1 間接ELISA法檢測(cè)不同稀釋比例病毒的抗體特異性Table 1 Detection of antibody specificity of viruses with different dilution ratios by indirect ELISA

圖8 單克隆抗體與PEDV N蛋白反應(yīng)的Western blot鑒定Fig.8 Western blot identification of monoclonal antibodies reacting with PEDV N protein

2.6 N蛋白單克隆抗體孵育時(shí)間

N蛋白單克隆抗體4 ℃條件下過(guò)夜孵育和37 ℃條件下孵育2 h，均能觀察到亮度無(wú)明顯差別的綠色熒光 (圖 11)。

圖9 不同稀釋度N蛋白單克隆抗體的間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Indirect immuno-fluorescenece assay results of N protein monoclonal antibodies at different dilution ratios

2.7 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 特異性試驗(yàn) 在已接種 TGEV、CSFV、PRRSV、PRV、PEAV、PoRV、PEDV 的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入 1∶1 000稀釋的 PEDV N 蛋白單抗、1∶100稀釋的 FITC–羊抗鼠–IgG，同時(shí)設(shè)立PEDV陽(yáng)性對(duì)照和正常細(xì)胞的陰性對(duì)照，然后置于熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，除接種PEDV的細(xì)胞有明顯的特異性熒光顯色外，接種 TGEV、CSFV、PRRSV、PRV、PEAV、PoRV的細(xì)胞均無(wú)特異性熒光，說(shuō)明建立的PEDV間接免疫熒光檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性(圖 12)。

圖10 不同稀釋度FITC-羊抗鼠IgG的間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果Fig.10 Indirect immuno-fluorescenece assay results of FITC–goa–anti–mouse IgG at different dilution ratios

圖11 N蛋白單克隆抗體孵育時(shí)間的確定Fig.11 Determination of incubation time of N protein monoclonal antibody

2.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次（圖 13a、13b）和不同批次（圖13c）的Vero細(xì)胞接種病毒，采用間接免疫熒光法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度一致，說(shuō)明重復(fù)性好。

2.7.3 敏感性試驗(yàn) 在已接種不同稀釋度 PEDV病毒液的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入用PBS緩沖液按體積比 1∶1 000稀釋的PEDV N蛋白單克隆抗體、用PBS緩沖液按體積比1∶100稀釋的FITC?羊抗鼠IgG，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞為空白對(duì)照，然后置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果表明，將PEDV病毒液稀釋到100 000，在熒光顯微鏡下仍可觀察到典型的特異性綠色熒光(圖14)。

圖12 間接免疫熒光特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.12 Specific test results of indirect immuno-fluorescenece assay

圖13 間接免疫熒光試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.13 Repeatability test results of indirect immuno-fluorescenece assay

圖14 間接免疫熒光試驗(yàn)敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.14 Sensitivity test results of indirect immuno-fluorescenece assay

3 討論與結(jié)論

我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中PEDV感染十分普遍[16]，3～10日齡的仔豬最為易感，病死率為80%～100%[17]，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失[9-10]。在臨診癥狀和病理變化上，除與豬傳染性胃腸炎十分相似外，PED還與PEAV、PoRV、致病性大腸埃希菌引起的病征相似。因此，建立一種PED的實(shí)驗(yàn)室診斷方法具有重要實(shí)踐意義。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PEDV N蛋白。相比其他表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜、表達(dá)量大等優(yōu)點(diǎn)。在單克隆抗體的制備過(guò)程中，蛋白的純度要求高，本研究利用PET-32a(+)載體上自帶的HIS標(biāo)簽與Ni柱反應(yīng)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色證明獲得了高純度的目的蛋白，用此蛋白作為免疫原免疫小鼠，小鼠的效價(jià)達(dá)到1∶80 000以上，證明該目的蛋白具有很好的免疫原性。

PEAV、PoRV、TGEV感染豬只后，臨診癥狀與PEDV相似，并且TGEV、PoRV接種Vero細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞病變和PEDV也相似；因此，僅僅依靠臨診癥狀和細(xì)胞病變難以鑒別診斷。本研究建立的免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)方法經(jīng)過(guò)特異性試驗(yàn)的驗(yàn)證，除了與PEDV有特異性反應(yīng)可以觀察到明顯的綠色熒光外，與其他的病原沒(méi)有交叉反應(yīng)。

綜上所述，本研究利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建PET-N重組質(zhì)粒，表達(dá)了PEDV N蛋白，制備了PEDV N單克隆抗體，并利用此抗體建立了檢測(cè)PEDV的間接免疫熒光試驗(yàn)方法，為PEDV的流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷和疫情控制提供了技術(shù)支撐。