吳坤鐘，李榮松，曹 陽，黃志君，田 鈴

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物功能基因組學(xué)與分子育種重點實驗室/廣東省蠶桑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642)

李斯特菌屬Listeria是革蘭陽性菌，隸屬厚壁菌門Firmicutes芽孢桿菌綱Bacilli芽孢桿菌目Bacillales，該屬包括17個種。狹義上的李斯特菌屬包括6個種，即單增李斯特菌L.monocytogenes、綿羊李斯特菌L.ivanovii、威爾斯李斯特菌L.welshimeri、默氏李斯特菌L.murrayi、西爾李斯特菌L.seeligeri和英諾克李斯特菌L.innocua，公認(rèn)的致病菌只有2種，即單增李斯特菌和綿羊李斯特菌[1-2]。其中單增李斯特菌致病性最強，可導(dǎo)致人與動物患李斯特菌病[3]。綿羊李斯特菌又稱伊氏李斯特菌，僅能引起動物李斯特菌病[4]，但也有引起人患李斯特菌病的個別案例[2]。此外，非常罕見英諾克李斯特菌和西爾李斯特菌引起人李斯特病的報道，且二者不具有溶血活性，因此它們一般被認(rèn)為是非致病菌。其中，英諾克李斯特菌常伴隨單增李斯特菌出現(xiàn)，并被視為后者的指示菌[5]。李斯特菌屬成員的中間宿主范圍較廣，常常生存于蔬菜、乳類和肉類制品中；適應(yīng)性強，在2～42 ℃均能正常生長[6-7]。李斯特菌病的潛伏期一般小于24 h[8]，臨床表現(xiàn)為腦膜炎、菌血癥、眼內(nèi)炎、頸淋巴結(jié)炎、膽囊炎、骨髓炎及關(guān)節(jié)炎等，易感人群為老人、孕婦、新生兒和免疫缺陷患者[9]。在動物中，由綿羊李斯特菌引起的李斯特菌病可表現(xiàn)為流產(chǎn)、敗血癥等，但不引起腦膜炎[10]。鑒于李斯特菌有危害性大、宿主譜廣和適應(yīng)性強的特點，很多國家都已經(jīng)采取相關(guān)措施防控食品中李斯特菌的污染，一些發(fā)達國家如美國等已將李斯特菌病定為法定傳染病，但目前我國僅在部分省市對李斯特菌病開展相關(guān)檢測工作[11]。

目前對李斯特菌的研究多集中在單增李斯特菌上，對其他李斯特菌的研究較少。已知的單增李斯特菌毒力因子主要有溶血素基因hly編碼的李斯特溶血素 O(Listerriolysin O，LLO)、plcA編碼的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(Phospholipase C，PIPLC)、plcB基因編碼的磷脂酰膽堿磷脂酶(Phosphatidylcholine-specific phospholipase C，PCPLC)、SmcL基因編碼的神經(jīng)磷脂酶C(Nerve phoshpolipase C，NPI-PLC)、肌動蛋白 A (Actin A，Act A)、內(nèi)化素 (Internalins，Inl)和細(xì)胞壁水解酶(p60)[12]。其中LLO是重要的毒力因子，相對分子質(zhì)量為60 000，是一種孔成形毒素，與細(xì)胞膜表面分子結(jié)合后可以直接插入細(xì)胞膜上，是李斯特菌逃逸初級吞噬和雙層膜吞噬體所必須的毒力因子[13-14]。此外，LLO還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子表達，從而誘導(dǎo)樹突細(xì)胞凋亡。當(dāng)李斯特菌借助細(xì)胞內(nèi)吞侵入宿主細(xì)胞后被包裹在吞噬體中，隨后李斯特菌分泌LLO和PI-PLC裂解吞噬體膜，從而逃逸進入宿主細(xì)胞漿中[15]。但此時，李斯特菌仍存在被宿主細(xì)胞自噬所清除的危險，而Act A在李斯特菌從宿主胞質(zhì)中逃逸的過程中發(fā)揮著重要的作用[16]。Act A是一種表面蛋白，當(dāng)李斯特菌逃出吞噬體進入細(xì)胞漿中時，Act A可以模仿Wiskott-Aldrich綜合征蛋白 (Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP)機制，調(diào)用宿主細(xì)胞自身的肌動蛋白，這些肌動蛋白在李斯特菌一端形成1條彗星狀的尾巴，賦予李斯特菌在胞質(zhì)中運動的能力，并向鄰近的細(xì)胞遷移，實現(xiàn)細(xì)胞間侵染[17]。Act A還可以與宿主細(xì)胞中的Ena/VASP和Arp2/3復(fù)合體相結(jié)合，以此逃避宿主細(xì)胞的自噬識別系統(tǒng)[18]。

研究表明，英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的關(guān)系密切，兩者可能具有共同的毒力祖先，在進化過程中英諾克李斯特菌丟失了編碼主要毒力因子的基因[19]。英諾克李斯特菌在基因組上與單增李斯特菌非常相似，例如兩者都有300多個編碼運輸?shù)鞍椎幕?，包?0多個碳轉(zhuǎn)運蛋白，兩者都含有糖酵解所必需的酶[20]。典型的英諾克李斯特菌已在進化過程中缺失了LIPI-1毒力島，但Johnson等[21]和Moura等[22]研究發(fā)現(xiàn)某些天然非典型英諾克李斯特菌株卻含有完整的LIPI-1毒力島，這類菌株具有溶血活性，可以主動穿過腸上皮，傳播到肝臟和脾臟，但危害程度遠(yuǎn)低于單增李斯特菌。由于英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的親緣關(guān)系最為接近，所以在一些食品的研究中，英諾克李斯特菌常常作為單增李斯特菌的替代菌種[23]。例如，Sorrentino等[24]發(fā)現(xiàn)在低pH條件下3?苯基乳酸可以抑制英諾克李斯特菌的生長。另外Tremonte等[25]發(fā)現(xiàn)，英諾克李斯特菌在面對酸脅迫時會顯著上調(diào)普遍脅迫蛋白(Universal stress protein，USP)基因的表達，表明在抵御酸脅迫時USP基因發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

目前，李斯特菌引起的相關(guān)并發(fā)癥尚無特效藥，也鮮有其侵染后寄主基因組水平的詳細(xì)反應(yīng)情況的研究報道。由于典型的英諾克李斯特菌被認(rèn)為是非致病菌[26]，人們對宿主與其互作的機制關(guān)注較少。鑒于英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的親緣關(guān)系最近，我們?nèi)绻軌蛏钊胪诰蚱淝秩竞笏拗骰虮磉_的變化情況，將為宿主調(diào)控、防御單增李斯特菌的危害提供對比與參考。利用英諾克李斯特菌可以侵染果蠅Drosophila melanogasterS2細(xì)胞的特性，我們在英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后，對果蠅S2細(xì)胞進行了轉(zhuǎn)錄組測序。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與菌株的培養(yǎng)

英諾克李斯特菌(ATCC，33090，由上海海洋大學(xué)提供)用李斯特菌培養(yǎng)基(HB4160，海博生物技術(shù)有限公司)活化和培養(yǎng)。果蠅S2細(xì)胞(由中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所提供)在含有體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清(FBS500-S，AusGeneX，澳大利亞)的 Insect SIM SF 培養(yǎng)基 (MSF1-1，信和生物公司)中培養(yǎng)。

1.2 英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞

果蠅S2細(xì)胞鋪板培養(yǎng)18 h后，用50 nmol/L水溶性膽固醇 (134428，BIOBERRY)孵育 30 min。

試驗組處理：膽固醇孵育30 min后加入英諾克李斯特菌懸浮液(約20個細(xì)菌)在28 ℃條件下孵育1.5 h。然后用pH 7.4的PBS緩沖液洗滌果蠅S2 細(xì)胞，在含 100 μmol/L CuSO4和 10 μg/mL 慶大霉素的Insect SIM SF培養(yǎng)基基中繼續(xù)培養(yǎng)果蠅S2細(xì)胞3 h。對照組處理：不加英諾克李斯特菌懸浮液，其他操作同試驗組。培養(yǎng)結(jié)束后，收集試驗組和對照組果蠅S2細(xì)胞進行后續(xù)試驗。

1.3 RNA的抽提及轉(zhuǎn)錄組測序

用 TRIzol試劑 (9108-1，Takara，日本)抽提感染英諾克李斯特菌后的果蠅S2細(xì)胞中的總RNA。使用 2100 Bioanalyze(Agilent Technologies，美國)定量總RNA模板。通過凝膠電泳確定每個樣品中總RNA的完整性。根據(jù)濃度和質(zhì)量值，分別選取試驗組與對照組3個最好的RNA樣品用于文庫制備和Illumina Novaseq 6000測序。原始配對的末端讀數(shù)修整后由SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)使用默認(rèn)參數(shù)進行質(zhì)量控制。然后使用TopHat軟件 (http://tophat.cbcb.umd.edu/，版本2.1.1)以定向模式將原始的讀數(shù)與參考基因組比對。根據(jù)每百萬條映射片段中每千個堿基的轉(zhuǎn)錄本所包含的片段 (Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，F(xiàn)PKM)計算每個轉(zhuǎn)錄本的表達水平。使用RSEM軟件(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)定量基因豐度。R統(tǒng)計軟件包EdgeR(http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html)用于基因差異表達分析。此外，使用Goatools(https://github.com/tanghaibao/Goatools)和 KOBAS 2.1.1 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php)進行GO和KEGG分析。對照組和試驗組樣品均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.4 實時定量PCR檢測

對差異基因進行qPCR驗證：用TRIzol試劑分別提取對照組與試驗組果蠅S2細(xì)胞的總RNA，使用 PrimeScriptTM RT 試劑盒 (RR047A，Takara，日本)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，進行qPCR檢測。以果蠅的rp49基因作為內(nèi)參基因。對照組和試驗組樣品均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

利用qPCR對英諾克李斯特菌的增殖情況進行檢測：英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后，收集果蠅S2細(xì)胞，用基因組提取試劑盒(D3129-01，Magen)提取總基因組，以此為模板，以果蠅rp49基因作為內(nèi)參基因，用英諾克李斯特菌的凋亡抑制蛋白 (Inhibitor of apoptosis protein，IAP)基因特異性引物進行qPCR檢測英諾克李斯特菌的增殖情況[27]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用 Microsoft Office Excel2010 軟件繪圖。試驗組和對照組的差異顯著性通過t檢驗進行統(tǒng)計分析。

按以下公式計算每個基因的差異表達倍數(shù)：

2 結(jié)果與分析

2.1 英諾克李斯特菌在果蠅S2細(xì)胞內(nèi)的增殖情況

利用qPCR對英諾克李斯特菌的增殖情況進行檢測，結(jié)果表明，英諾克李斯特菌的IAP基因拷貝數(shù)劇烈上升，果蠅S2細(xì)胞中侵染了大量的英諾克李斯特菌(圖1)。因此，我們在英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后收集果蠅S2細(xì)胞提取總RNA用于轉(zhuǎn)錄組測序以及后續(xù)的qPCR驗證。

2.2 果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與評估

對照組和試驗組分別平均產(chǎn)生了59 125 670和 60 779 885 條原始數(shù)據(jù)，錯誤率均在 0.025 6% 以下(表1)。果蠅S2細(xì)胞被英諾克李斯特菌侵染前基因組的GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)在50%左右，被侵染3 h后基因組GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大(表1)。對照組和試驗組的3次生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性系數(shù)均在0.994 9以上，表明各組之間重復(fù)性良好，可進行下一步分析。

圖1 英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后英諾克李斯特菌增殖情況Fig.1 Proliferation ofListeria innocua after its infection in Drosophila S2 cells for three hours

表1 果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Table 1 Statistics of transcriptome sequencing data forDrosophila S2 cells

2.3 果蠅S2細(xì)胞基因表達差異

英諾克李斯特菌侵染宿主果蠅S2細(xì)胞3 h后，韋恩分析表明對照組與試驗組共同表達的基因有7 808個，僅在試驗組表達的基因有98個，僅在對照組表達的基因有187個。

與對照組相比，試驗組共有54個基因呈現(xiàn)顯著性差異(上/下調(diào)倍數(shù)≥2)，其中21個基因上調(diào)，33個基因下調(diào)，變化幅度最大的是DmCR46081，上調(diào)了232倍，其次是DmDef(DmDefensin)、DmDro(DmDrosomycin)、DmDpt A(DmDptericin A)和DmDpt B(DmDptericin B)等抗菌肽基因。DmCR46081基因編碼rRNA前體加工蛋白，提示果蠅S2細(xì)胞被英諾克李斯特菌侵染后某些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平大幅度提升(表2)。

2.4 果蠅S2細(xì)胞差異表達基因的功能注釋分析

GO注釋分析顯示，21個上調(diào)的基因共涉及10個GO條目，可分為生物進程、細(xì)胞組分和分子功能3大類，其中富集基因數(shù)目最多的GO條目分別是胞外區(qū)(9個)、應(yīng)激反應(yīng)(5個)、代謝進程(4個)、免疫系統(tǒng)進程(4個)、多細(xì)胞生物進程(3個)、催化活性 (3個)、結(jié)合 (3個)、細(xì)胞進程(1個)、細(xì)胞成分組織或生物合成(1個)、胞外區(qū)組件 (1 個)(表 3)。

下調(diào)的33個基因共涉及22個GO條目，其中富集基因數(shù)最多的GO條目分別是催化活性(11個)、代謝進程(10個)、細(xì)胞膜(10個)、單組織進程(8個)、細(xì)胞膜組件(8個)、結(jié)合(8個)、細(xì)胞進程(7 個)、定位 (6 個)、細(xì)胞 (6 個)、細(xì)胞組件 (6 個)、細(xì)胞器(4個)、細(xì)胞器組件(3個)、大分子復(fù)合物(3個)、轉(zhuǎn)錄活性(3個)、排毒(1個)、生物進程調(diào)控(1個)、多細(xì)胞組織進程(1個)、生物調(diào)控(1個)、應(yīng)激反應(yīng)(1個)、胞外區(qū)(1個)、抗氧化活性(1個)、電子轉(zhuǎn)運活性(1個)(表4)。

結(jié)果顯示，上調(diào)基因多集中在胞外區(qū)，下調(diào)基因多集中在代謝進程、細(xì)胞膜和催化活性，說明被英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細(xì)胞的某些代謝反應(yīng)下降。

表3 英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細(xì)胞上調(diào)基因GO注釋Table 3 GO annotation of upregulated genes inDrosophila S2 cells afterListeriainnocua infection

2.5 果蠅S2細(xì)胞差異表達基因的富集分析

2.5.1 上調(diào)基因 KEGG 富集 KEGG 富集分析表明，顯著上調(diào)的21個基因只注釋到1個KEGG 通路，即Toll/Imd通路(P<0.001)，包括4個果蠅抗菌肽基因DmDpt A、DmDef、DmCec A2(Cecropin A2)和DmCec B(Cecropin B)。

2.5.2 下調(diào)基因 KEGG 富集 KEGG 富集分析結(jié)果(表5)表明，下調(diào)的33個基因注釋到23個KEGG 通路。

表5 英諾克李斯特菌侵染后果蠅S2細(xì)胞下調(diào)基因KEGG富集表Table 5 KEGG enrichment of downregulated genes inDrosophila S2 cells afterListeriainnocua infection

2.6 免疫相關(guān)通路中的基因分析

英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)經(jīng)GO注釋和KEGG富集分析顯示，顯著上調(diào)的基因主要與免疫相關(guān)。從24個KEGG通路中篩選出10個與免疫相關(guān)的KEGG 通路，分別是Toll/Imd通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、吞噬體、霍亂弧菌感染、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號傳導(dǎo)、NOD樣受體信號通路、鉑耐藥、結(jié)核、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、mTOR信號通路，共涉及到8個基因，其中上調(diào)幅度最大的是DmDef，上調(diào)了9.805倍，下調(diào)幅度最大的是DmDhd，下調(diào)了4.329倍。

2.7 果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中抗菌肽的qPCR驗證

英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后，變化最為顯著的基因類群為抗菌肽。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞3 h后共10個抗菌肽基因顯著上調(diào)，包括DmDef、DmDro、DmDpt A、DmDpt B、DmCec A2、DmCec B、DmMtk(DmMetchnikowin)、DmAtt D(DmAttacin D)、DmAtt A(DmAttacin A)、DmAtt B(DmAttacin B)，其中上調(diào)幅度最大的是DmDef(表2)。

我們選取9個抗菌肽基因，利用qPCR進行了驗證，其中上調(diào)幅度最大的是DmMtk，上調(diào)8.180 倍，DmAtt A上調(diào) 7.533 倍，DmDro上調(diào)7.204 倍，DmDef上調(diào) 4.569 倍 (圖 2)，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的趨勢基本一致，說明英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后，抗菌肽基因受到顯著的誘導(dǎo)表達。

圖2 免疫相關(guān)基因表達的qPCR驗證結(jié)果Fig.2 qPCR verification results for expression of immune related genes

3 討論與結(jié)論

已知的果蠅免疫信號通路有3條，分別是Toll通路、Imd通路和JAK/STAT通路。果蠅雖然沒有獲得性免疫，但是依然能對不同病原菌的入侵做出不同的先天免疫反應(yīng)，革蘭陽性菌和真菌所引起的免疫反應(yīng)主要由Toll通路介導(dǎo)，而革蘭陰性菌和細(xì)胞壁含DAP型肽聚糖的陽性菌引起的免疫反應(yīng)主要由Imd通路介導(dǎo)[28-29]。Toll通路或Imd通路被激活后可誘導(dǎo)下游抗菌肽的表達[30]。已知的果蠅抗菌肽主要有7種，分別是Attacin、Diptericin、Drosocin、Defensin、Cecropin、Metchnikowin 和Drosomycin?？咕牡谋磉_由Toll和Imd通路調(diào)控，若Toll通路和Imd通路缺失，將不能誘導(dǎo)抗菌肽的表達[31-33]。

英諾克李斯特菌屬于革蘭陽性菌，其細(xì)胞壁肽聚糖成分主要為DAP型肽聚糖[34]，DAP型肽聚糖可以激活果蠅的Imd通路。已有研究表明，果蠅的PGRP-SD作為胞外受體不參與Toll通路，而是參與Imd通路的激活[35]。本研究發(fā)現(xiàn)DmPGRPSD出現(xiàn)顯著上調(diào)，提示英諾克李斯特菌侵染果蠅S2細(xì)胞后Imd通路可能被激活?？咕腁ttacin、Cecropin和Diptericin的表達主要受Imd通路的調(diào)控[36-37]，本研究結(jié)果顯示果蠅的抗菌肽基因DmAtt A、DmAtt B、DmAtt D和DmCec A2和DmCec B均出現(xiàn)顯著上調(diào)，顯示了Imd通路的激活。而抗菌肽 Drosomycin、Defensin和Metchnikowin的表達主要受Toll通路調(diào)控[38]，本研究結(jié)果中顯示果蠅的抗菌肽基因DmDro、DmDef和DmMtk也出現(xiàn)了顯著上調(diào)，提示英諾克李斯特菌可能同時引起了Imd和Toll通路的激活，但具體是Toll通路還是Imd通路起主要作用，則需要進一步的研究。抗菌肽被認(rèn)為具有廣譜性，但Hanson等[39]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽針對某些病原微生物具有特異性，Imd通路調(diào)控的抗菌肽對單增李斯特菌并不起作用[34]。Hanson等[39]研究還發(fā)現(xiàn)果蠅的spz基因缺失后對英諾克李斯特菌表現(xiàn)出極高的敏感性，提示在抵御英諾克李斯特菌的過程中，Toll通路調(diào)控的抗菌肽起重要作用。鑒于上述研究結(jié)果和單增李斯特菌與英諾克李斯特菌相近的親緣關(guān)系，猜測宿主在抵御英諾克李斯特菌和單增李斯特菌侵染的過程中Toll通路調(diào)控的抗菌肽可能起到關(guān)鍵作用，但Toll通路的激活機制需要進一步深入研究。

英諾克李斯特菌作為一種胞內(nèi)寄生菌，通過內(nèi)吞作用侵入宿主細(xì)胞后會被包裹在吞噬體中，英諾克李斯特菌在宿主細(xì)胞中的增殖需要它從宿主的吞噬體中逃逸至細(xì)胞質(zhì)中，我們注意到液泡型H+離子腺苷三磷酸酶 (Vacuolar H+-ATPase，VATPase)基因DmVha68-3和DmVha100-4均出現(xiàn)了顯著下調(diào)，KEGG富集結(jié)果顯示它們富集到吞噬體等通路中。DmVha68-3編碼果蠅V-ATPase-A亞基，DmVha100-4編碼V-ATPase-a亞基，為VATPase復(fù)合體形成的關(guān)鍵亞基[40]，V-ATPase廣泛存在于細(xì)胞器膜上，如內(nèi)體、溶酶體及吞噬體膜，可以將H+泵入這些細(xì)胞器中以維持這些細(xì)胞器的相對酸性內(nèi)環(huán)境，促進細(xì)胞器對內(nèi)吞或是細(xì)胞自噬包裹的底物或是入侵的微生物進行降解[41-42]。單增李斯特菌的毒力因子LLO正常發(fā)揮作用時需要酸性環(huán)境，在pH 5.6時LLO的溶血活性最高，當(dāng)pH超過7.0時LLO的活性基本喪失[43]。典型的英諾李斯特菌缺失毒力島，而其侵染果蠅S2細(xì)胞后上述2個DmV-ATPase基因的下調(diào)是否跟毒力島缺失有關(guān)目前尚不清楚，值得我們今后深入思考。此外，是否可以通過調(diào)控宿主細(xì)胞的V-ATPase活性從而抑制單增李斯特菌毒力因子LLO的活性對其進行防控，也是有益的思考。