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BioPRYN 酶聯(lián)免疫方法檢測牛早孕的應(yīng)用研究

2020-08-05 08:12
中國奶牛 2020年7期
關(guān)鍵詞:空懷天數(shù)孵育

(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司,呼和浩特 011517)

國際上通常將奶牛從分娩到首次適宜輸精的時間間隔稱為“自愿等待期”(voluntary waiting period,VWP)[1]。不同奶牛之間的最佳VWP不同,37%的奶牛最佳VWP為6周,63%的奶牛最佳VWP小于8周,大約10%的牛VWP大于9周。奶牛產(chǎn)奶需要經(jīng)過配種、懷孕、分娩等環(huán)節(jié)。配種技術(shù)相對較易掌握,但如何在配種后的等待期及早進(jìn)行妊娠鑒定,以發(fā)現(xiàn)空懷奶牛,及時補(bǔ)配并縮短胎間距,以實現(xiàn)產(chǎn)奶量和利潤的最大化則是相對復(fù)雜而且十分重要的問題。據(jù)統(tǒng)計,每增加一天空懷,飼料成本增加40元以上。按照減少15d的空懷天數(shù)來計算,每頭牛可節(jié)省成本600元。理想的早期妊娠診斷技術(shù)應(yīng)該包括以下特點:①在配種后一個發(fā)情周期之內(nèi)顯示出診斷結(jié)果;②對于妊娠和未妊娠家畜的診斷準(zhǔn)確率在 85%以上;③對母體和胎兒無害;④方法簡便、準(zhǔn)確實用[2]。近些年早期妊娠診斷方法高速發(fā)展,新方法不斷涌現(xiàn),一些曾處于實驗發(fā)展階段的方法[3]逐漸成熟。通過檢測奶牛血液中妊娠特異性蛋白(PSPB)含量作為判斷妊娠標(biāo)志的方法便是其中之一,該方法在奶牛及相近物種的妊娠檢測中具有較高的靈敏度、特異性以及準(zhǔn)確性[4]。PSPB來源于胚胎組織,在雙核細(xì)胞遷移下進(jìn)入血液循環(huán),有些奶牛在配種后15d開始產(chǎn)生PSPB,所有的奶牛從懷孕后第28天開始都會產(chǎn)生PSPB[5],一直到整個妊娠周期都在血液中以不同濃度存在,與懷孕天數(shù)有著良好的相關(guān)性[6]。美國BioTracking公司的BioPRYN早孕診斷試劑盒依據(jù)酶聯(lián)免疫原理可以對懷孕早期奶牛血液中的PSPB進(jìn)行檢測。本研究旨在評價該方法的檢測準(zhǔn)確性從而豐富牧場懷孕奶牛的早期診斷手段,服務(wù)于生產(chǎn)管理,增進(jìn)牧場收益[7]。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

配后待檢母牛92頭,其中呼和浩特蒙德隆牧場26頭(配種后30~380d),呼和浩特賽罕牧場66頭(配種后17~183d)。

1.2 主要試劑與儀器

BioPRYN牛早孕檢測試劑盒,購自美國BioTracking公司。

離心機(jī)(型號為5424R),購自德國Eppendorf公司;酶標(biāo)儀(型號為ELx808IU),購自美國BioTek公司;20~200mL移液器(型號為Transferpette),8道移液器(型號為Transferpette-8),購自德國BRAND公司;洗板機(jī)(型號為ELX508),購自美國BioTek公司;旋渦混合儀(型號為MS3 BASIC),購自德國IKA公司。

1.3 BioPRYN 牛早孕檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

以吸光度值為縱坐標(biāo),以PSPB濃度值為橫坐標(biāo)繪制BioPRYN標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 BioPRYN 牛早孕檢測試劑盒法及觸診法檢測奶牛懷孕狀況比對

1.4.1 傳統(tǒng)直腸檢查觸摸診斷法檢測奶牛懷孕情況

繁殖技術(shù)人員通過直腸檢查,依據(jù)黃體的方位、發(fā)育生長態(tài)勢,子宮角的變化大小,子宮角內(nèi)壓力與波動感的狀態(tài),子宮壁柔軟程度以及觸摸有無胎膜的滑落感來判定奶牛是否受孕[5]。

1.4.2 BioPRYN牛早孕診斷試劑盒檢測奶牛懷孕情況

首先利用真空采血管采集母牛血液樣本,然后用BioPRYN牛早孕診斷試劑盒進(jìn)行檢測。第一步,加樣孵育:用樣品緩沖液50μL濕潤酶標(biāo)孔,之后分別添加標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液150μL,用蓋板膜密封,蓋好微孔蓋,在室溫20~25℃下孵育4h;第二步,檢測反應(yīng):孵育結(jié)束后,取下蓋板膜,用洗滌液沖洗酶標(biāo)板4次,添加檢測溶液室溫再次孵育1h;第三步,增強(qiáng)反應(yīng):1h孵育結(jié)束后再次洗板2次,加入增強(qiáng)試劑(即酶標(biāo)抗體),于室溫孵育1h;第四步,顯色反應(yīng):增強(qiáng)反應(yīng)結(jié)束后,洗板4次,之后每孔加入TMB底物試劑200μL,室溫反應(yīng)15min;第五步,終止反應(yīng):每孔加入100μL終止液;第六步,結(jié)果讀取:加入終止液后30min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù),讀數(shù)波長為650nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 BioPRYN牛早孕診斷試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 BioPRYN試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.9951,PSPB濃度和吸光度值之間具有良好的線性相關(guān)性,見圖1。

2.2 觸診結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果比對

表1 92組樣本的觸診法及BioPRYN 酶聯(lián)免疫試劑盒法檢測結(jié)果

表1數(shù)據(jù)看出,92組檢測結(jié)果,兩種方法最終得出一致結(jié)論的有87組,不一致的有5組,總體符合率為94.6%。其中得出不一致結(jié)論的5組奶牛配種天數(shù)為26~34d,可能是由于在奶牛配種后一個月左右的初始階段,PSPB在不同奶牛個體血液中的含量不夠穩(wěn)定,存在差異,處在試劑盒檢出限濃度附近,導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏差。橫向比對配種天數(shù)處于35d及以下奶牛試劑盒檢測結(jié)果的OD值,介于0.045~0.804之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為50.9%。

此外,在BioPRYN方法的檢測結(jié)果中,存在2例Recheck的結(jié)果,配種天數(shù)分別為27d和30d,占檢測總數(shù)的1.8%。一般情況下,Recheck的結(jié)果均建議7d后重檢,數(shù)據(jù)中Recheck對應(yīng)的BioPRYN OD值分別為0.150和0.158,在低Recheck的0.135~0.160范圍內(nèi),因此該結(jié)果可看作為較多空懷概率。一周后觸診法復(fù)檢均為空懷。

BioPRYN方法檢測結(jié)果中有69例為懷孕,配種天數(shù)為26~183d,占比75.0%;21例為空懷,配種天數(shù)為34~380d,占比22.1%。兩周后用觸診法進(jìn)行檢查,有64例懷孕,占比69.6%,而空懷有28例,占比30.4%。如果以觸診法為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果,且試劑盒Recheck檢測結(jié)果為陰性,則利用BioPRYN方法檢測為空懷23例(含Recheck結(jié)果),觸診確認(rèn)均為空懷,先空懷后孕結(jié)果的概率為0,即BioPRYN的空懷結(jié)論用觸診法100.0%證實,準(zhǔn)確率為100.0%,假陽性率為0。利用BioPRYN方法檢測懷孕69例,觸診確認(rèn)懷孕64例,有5例結(jié)果不一致,準(zhǔn)確率為92.8%,假陰性率為7.2%。

3 討論

從檢測結(jié)果分析可知,BioPRYN技術(shù)檢測未孕奶牛準(zhǔn)確率為100.0%,實際應(yīng)用中可以在母牛配種26d以后,對全體母牛進(jìn)行BioPRYN檢測,如果結(jié)果為空懷,可以直接進(jìn)行配種準(zhǔn)備;如果結(jié)果為懷孕,則應(yīng)分為兩種情況:①為了避免BioPRYN技術(shù)的檢測誤差,一周后應(yīng)利用其他孕檢方法進(jìn)行復(fù)檢,確保結(jié)果準(zhǔn)確;②奶牛懷孕是一個持續(xù)的過程,存在一定的自然流產(chǎn)率。根據(jù)美國統(tǒng)計的奶牛數(shù)據(jù),30d左右確認(rèn)懷孕后又在60d左右確認(rèn)流產(chǎn)的概率為10%~18%。因此可以在母牛配種后42~49d,對已確認(rèn)懷孕的奶牛中OD值較小的牛只進(jìn)行復(fù)檢,根據(jù)復(fù)檢結(jié)果進(jìn)行不同處理。同時與26d的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,數(shù)據(jù)明顯變小的牛只需重點查看;在母牛配種60~67d,為了避免10%~18%的“先孕后空懷”的空懷牛只遺漏未查出以致錯過配種時間,建議對全體奶牛進(jìn)行再一次BioPRYN檢測。但需根據(jù)牧場的實際情況,計算以往的流產(chǎn)比率和再次全體檢測的投入費(fèi)用,以衡量是否再進(jìn)行全面檢查,或用合適的方法進(jìn)行檢查。

綜上,BioPRYN技術(shù)檢測奶牛未孕的準(zhǔn)確率可達(dá)100.0%,懷孕的準(zhǔn)確率可達(dá)92.8%。檢測簡便而快速,可以在早期對奶牛受孕情況進(jìn)行大通量排查,同時可以配合傳統(tǒng)檢測方法及時發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)奶牛[8],為規(guī)?;翀瞿膛E浞N管理和成本控制提供技術(shù)保障。

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