韓沁 鄒迪新 李二文 李芝奇 徐玥 趙崇軍 林瑞超

摘要?目的：比較芫花水提取物對斑馬魚成魚及SD大鼠肝毒性作用的相似性，并初步探討芫花肝毒性作用機(jī)制。方法：選取斑馬魚成魚320條，分為32組，每組10條（雌：雄=1：1），設(shè)置高、中、低劑量組和空白對照組，暴露處理96 h。SD大鼠24只，分為4組，每組6只，設(shè)置高、中、低劑量組和空白對照組，按照2.5 mL/200 g體質(zhì)量每日灌胃給藥1次，連續(xù)7 d。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，將斑馬魚成魚和大鼠處死并獲取肝臟組織。通過病理組織切片觀察其肝臟形態(tài)，以SOD、SDH、MDA、NOX、TG、ALT和AST等生化指標(biāo)為毒性評價指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上通過實(shí)時熒光定量PCR測定斑馬魚成魚肝臟相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果：病理組織切片顯示，芫花處理能夠引起斑馬魚成魚肝臟細(xì)胞變形、空泡，甚至凋亡，同時，芫花能夠引起大鼠肝臟細(xì)胞排列松散、空泡、形態(tài)皺縮、界限不清晰，細(xì)胞核形態(tài)成不規(guī)則狀并伴有出血現(xiàn)象.生化測定結(jié)果表明，芫花處理組斑馬魚成魚肝臟中SOD、SDH及NADH的酶活力均顯著降低（P<0.05），而MDA含量上升（P<0.01）;給藥組大鼠肝臟中SOD、SDH的活力均顯著下降（P<0.05），而MDA、TG含量升高（P<0.01），此外，低劑量給藥組大鼠ALT活力顯著性升高（P<0.05），所有給藥組中AST活力均有所升高（P<0.01）。qRT-PCR結(jié)果顯示，斑馬魚肝臟組織中線粒體功能相關(guān)基因mtatp6，mtco1，mtnd1，pklr表達(dá)水平下調(diào)（P<0.01），氧化應(yīng)激相關(guān)基因gstp2，nqo1，sod1的mRNA表達(dá)水平下調(diào)（P<0.01），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因包括atf4a，ern1，hsp90b1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P<0.01），自噬相關(guān)基因beclin-1和ATG3表達(dá)水平下調(diào)（P<0.01）。結(jié)論：芫花水提取物對斑馬魚成魚及SD大鼠肝臟均產(chǎn)生毒性作用，其作用機(jī)制可能為芫花能夠誘導(dǎo)斑馬魚肝臟組織中出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞?芫花;水提取物;斑馬魚;大鼠;肝毒性;基因表達(dá)

Abstract?Objective：To compare the similarity of hepatotoxicity effects of water extract from Genkwa Flos in adult zebrafish and SD rats，and to explore the action mechanism of hepatotoxicity effects of Genkwa Flos.Methods：A total of 320 adult zebrafish were divided into 32 groups（10 in each group，female：male=1∶1）.High，medium and low dose groups and the blank control group were set up，which were exposed for 96 hours.24 SD rats were divided into 4 groups（6 in each group）.The rats of high，medium，low dose group and the blank control group were administered once a day at a dose of 2.5 mL/200 g for 7 consecutive days.The adult zebrafish and rats were then sacrificed at the end of the experiment and liver tissues were collected.The liver morphology was observed through pathological tissue sections.SOD，SDH，MDA，NOX，TG，ALT，AST were used as indicators of toxicity assessment.Based on that，the expressions of apoptosis-related gene in the liver were detected by real-time quantitative PCR.Results：Pathological tissue sections showed that Genkwa Flos could cause deformation，vacuoles，and even apoptosis of the liver cells of zebrafish.At the same time，the water extract from Genkwa Flos could cause loosely arrangement，vacuoles，morphological shrinkage，unclear boundaries，irregular nucleus morphology with hemorrhage of the liver cells of rats.The activity of SOD，SDH and NADH in the liver of adult zebrafish was significantly decreased（P<0.05），while the activity of MDA was increased（P<0.01）.The result of biochemical indexes showed that the activity of SOD，SDH in the liver of rats was significantly decreased（P<0.05），while the activity of MDA，TG was increased（P<0.01）.In addition，the activity of ALT was significantly increased（P<0.05）in low dose group，and the activity of AST was increased（P<0.01）in all drug-administered group.The result of qRT-PCR showed that the expression of genes involved in mitochondrial function（mtatp6，mtco1，mtnd1，pklr）was decreased（P<0.01）in the liver of zebrafish，the mRNA expression of genes involved in oxidative stress（gstp2，nqo1，sod1）was decreased（P<0.01），the mRNA expression of genes involved in endoplasmic reticulum stress（atf4a，ern1，hsp90b1）was increased（P<0.01），the mRNA expression of genes involved in autophagy（beclin-1，ATG3）was decreased（P<0.01）.Conclusion：The water extract of Genkwa Flos has a toxic effect on the liver of zebrafish adults and SD rats.The mechanism may be that Genkwa Flos can induce oxidative stress damage，mitochondrial dysfunction，endoplasmic reticulum stress and zebrafish liver tissue.Cell autophagy，in turn induces liver cell apoptosis.

Keywords?Genkwa Flos; Water extract; Zebrafish; Rat; Hepatotoxicity; Gene expression

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.005

芫花，為瑞香科植物芫花Daphne genkwa Sieb.et Zucc的干燥花蕾，性苦、辛，溫，歸肺、脾、腎經(jīng)[1]，為傳統(tǒng)的瀉下逐水藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明芫花在鎮(zhèn)咳祛痰、引產(chǎn)、殺蟲、抗炎抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能等方面有較好療效[2]。盡管如此，臨床應(yīng)用和臨床前安全性研究報道的肝毒性大大限制了其廣泛的應(yīng)用。此外，關(guān)于芫花的毒性作用研究相對較少，研究內(nèi)容不夠深入，毒性機(jī)制尚不明確，在安全范圍內(nèi)缺乏大量的數(shù)據(jù)支撐其臨床安全使用。

斑馬魚除了繁殖快、成本低、高通量、實(shí)驗(yàn)周期短等獨(dú)特優(yōu)勢外，其還具有與哺乳動物的遺傳、生理和解剖同源性高的特征[3]。因此，斑馬魚在毒性評價中具有良好的預(yù)測和評價能力。在國外已廣泛應(yīng)用于藥物毒理性的篩選與評價[4]，國內(nèi)基于斑馬魚模型的中藥安全性研究也正日益興起[5-8]。前期我們已經(jīng)利用斑馬魚對芫花的肝毒性進(jìn)行初步探討[9]，但是，斑馬魚和傳統(tǒng)模型在中藥肝毒性響應(yīng)中是否存在相似性尚缺乏系統(tǒng)的支撐數(shù)據(jù)。

因此，本文以芫花為研究對象，分別選取斑馬魚成魚及SD大鼠為研究模型，探討芫花水提取物對斑馬魚模型和傳統(tǒng)的SD大鼠模型的肝臟毒性作用，比較斑馬魚模型與傳統(tǒng)體內(nèi)嚙齒類動物模型在芫花肝臟毒性響應(yīng)的相似性，為確認(rèn)斑馬魚模型在中藥肝毒性快速評價中的適用性提供參考依據(jù)，在此基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)初步探討芫花的肝臟毒性作用機(jī)制，以利于未來針對芫花炮制配伍減毒以及藥物深入開發(fā)和廣泛應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?斑馬魚親本購于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚（AB-type）由本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)繁育。斑馬魚的養(yǎng)殖繁育參照Zebrafish Book[10]。實(shí)驗(yàn)操作遵循OECD標(biāo)準(zhǔn)。養(yǎng)殖條件：水溫（28±0.5）℃，pH值7～7.2，電導(dǎo)率450～550 μs/cm，黑暗/光照周期為10 h/14 h，每日喂食豐年蝦幼蟲3次。SD大鼠（雌雄各半，體質(zhì)量180 g左右），購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證編號：11401500056003，飼料與墊料均由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)于屏障動物房，室溫（20±2）℃，通風(fēng)良好，環(huán)境舒適，黑暗與光照周期為12 h/12 h，并定期消毒。

1.1.2?藥物?芫花（安國圣山藥業(yè)有限公司提供）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為瑞香科植物芫花（Daphne genkwa Sieb.et Zucc.）的干燥花蕾。

1.1.3?試劑與儀器?NaCl（北京化工，批號：A1060005）、KCl（北京化工，批號：A1049003）、Na2HPO4（北京化工，批號：A1060056）、CaCl2（北京化工，批號：A1011002）、K2HPO4（北京化工，批號：A1049021）、MgSO4（北京化工，批號：A1037009）、NaHCO3（北京化工，批號：A1060001）;4%多聚甲醛（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號：de-0094）、水合氯醛（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號：biodee1212）;Bradford蛋白定量試劑盒（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，型號：W042）;RNA保護(hù)液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：R1100）;PBS緩沖液（Corning，美國，批號：21-040-CVR）;生理鹽水（北京百諾威生物科技有限公司，批號：pb30164）;超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，型號：A001-3-2）、琥珀酸脫氫酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，型號：A022-1-1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，型號：A003-4-1）、NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）試劑盒（南京建成生物工程研究所，型號：A116-1-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所，型號：A010-2-1）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine Aminotransferase，ALT）試劑盒（南京建成生物工程研究所，型號：A009-2-1）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒（南京建成生物工程研究所，型號：A110-1-1）;FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司，型號：KR116-01）;TransZol Up Plus RNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：ER501-01）;TransStart Top Green qPCR Super Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：AQ131-03）;豐年蝦（天津豐年蝦水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司）;12孔板（Corning，美國）;96孔低位PCR板（Axygen，美國，PCR-96-LP-AB-C）;20μL移液器（Eppendorf，德國，3121000040）;斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技公司）;光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本，PROVIS AX70）;恒溫培養(yǎng)箱（廣州瑞明儀器有限公司，型號：LRH-250Z型）;離心機(jī)（無錫瑞江分析儀器有限公司，型號：RJ-LDL-50G）;真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京歐萊德科學(xué)儀器有限公司，型號：SY-3000B）;酶標(biāo)儀（Biotek，美國，型號：Epoch2）;紫外-可見分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司，型號：UV-2000）;超微量分光光度計（賽默飛世爾科技公司，美國，型號：Nanodrop 2000）;全能型成像系統(tǒng)（Bio-rad，美國，型號：ChemiDoc MP）、實(shí)時熒光定量PCR儀（Bio-rad，美國，型號：CFX96）;Next Advance Bullet Blender快速組織樣品勻漿儀（Next Advance，Inc.公司，美國，型號：BB24-AU）。

1.2?方法

1.2.1?分組?選取健康的成年斑馬魚320條，雌雄各半，隨機(jī)均分為高、中、低劑量組和空白對照組共32組，每組10條（雌∶雄=1∶1）。SD大鼠24只，雌雄各半，隨機(jī)均分為4組（高、中、低劑量組和空白對照組），每組6只。

1.2.2?給藥方法

1.2.2.1?芫花樣品的制備?芫花水提取物的制備：稱取50 g芫花置于圓底燒瓶中，加10倍量水回流提取2 h，過濾，加10倍量水重新提取兩次，1 h/次。合并提取液，抽濾，濃縮，減壓干燥，研磨成粉末，置于干燥器中保存。芫花水提物儲備液的配制：精密稱取研磨后的芫花水提取物粉末0.102 0 g，溶于50 mL斑馬魚養(yǎng)殖水中，超聲助溶，配制成2 000 μg/mL的母液，分裝于5 mL離心管，放置于-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。芫花供試品溶液的配制：根?jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，用養(yǎng)殖水將母液稀釋至所需濃度即可。

1.2.2.2?給藥方法?斑馬魚成魚的暴露：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇健康的斑馬魚成魚（魚齡>6個月）進(jìn)行暴露給藥96 h，確定最大非致死濃度（15 μg/mL）。正式實(shí)驗(yàn)中，將成年斑馬魚分別暴露于高劑量（15 μg/mL）、中劑量（10 μg/mL）、低劑量（5 μg/mL）組的藥液中，同時設(shè)置養(yǎng)殖水為空白對照組，每日喂食豐年蝦3次，15 min后更換藥物暴露液。待成魚暴露96 h后，更換暴露液，用養(yǎng)殖水清洗斑馬魚兩次，將其快速置于冰上冷凍麻醉，稱重，解剖，顯微鏡下取其肝臟組織，所有解剖過程在冰浴的PBS中進(jìn)行，取出的肝臟組織樣本快速放入干凈的5 mL離心管中。SD大鼠給藥：參照臨床使用劑量，按照2.5 mL/200 g體質(zhì)量的給藥標(biāo)準(zhǔn)對高劑量（0.236 g/100 g）、中劑量（0.079 g/100 g）、低劑量（0.026 g/100 g）組的SD大鼠進(jìn)行灌胃給藥，空白對照組給予等量的生理鹽水溶液，灌胃1次/d，連續(xù)7 d，期間大鼠自行采食與飲水。待7 d后通過腹主動脈收集血液樣本，立即將動物處死并剖取肝臟。取小部分肝臟組織放入4%多聚甲醛溶液中，用于后續(xù)的病理組織學(xué)觀察，剩余的大部分組織切割成黃豆大小的樣本保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)的生化指標(biāo)檢測。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1?病理組織學(xué)評價?將收集好的成魚肝臟和SD大鼠肝臟的少量組織固定于4%的多聚甲醛緩沖液中12 h，然后在室溫下進(jìn)行脫水、透明處理，石蠟包埋，切成5 μm的薄片，HE染色后，置于顯微鏡下觀察。

1.2.3.2?生化指標(biāo)評價?將收集好的成魚肝臟樣本進(jìn)行SOD、SDH、MDA、NADH氧化酶活性測定，將SD大鼠肝臟樣本進(jìn)行SOD、SDH、MDA、ALT、AST、TG活性測定。所有生化評價試驗(yàn)均嚴(yán)格按照試劑盒中附帶的說明書進(jìn)行。

1.2.3.3?芫花水總提物對斑馬魚成魚肝臟毒性相關(guān)基因表達(dá)的影響?樣本的收集：在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，將成魚解剖獲得的肝臟組織轉(zhuǎn)入含有3 mL RNA保護(hù)液的5 mL離心管中，每5條成魚為一組。RNA提取及濃度、純度檢測：將收集好的樣本中的RNA保護(hù)液棄去，參照TRIzol試劑盒內(nèi)提供的說明書提取肝臟的總RNA。取少量提取所得RNA溶液與DEPC水按1∶10比例稀釋后，按照說明書在RNA濃度測定儀上測定RNA溶液濃度和純度。取1 L RNA模板加4 L RNase free Water和1 L 6×RNA/DNA Loading Buffer，在200 V條件下進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。RNA樣本的反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)試劑盒步驟對提取的RNA樣本進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄即得到cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)：以各樣品cDNA為模板，利用TransStart Top Green qPCR Super Mix試劑盒，按照說明書在CFX96 PCR儀中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和引物序列見表1～3，用于PCR的斑馬魚特異性引物是由Primer Premier 5.0軟件設(shè)計并由博邁德生物有限公司合成的。PCR擴(kuò)增方案為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 3 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 802統(tǒng)計軟件對以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用單因素方差分析（One-way ANO-VA）和LSD法進(jìn)行組建多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?芫花水提物對斑馬魚成魚及SD大鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，斑馬魚成魚及SD大鼠空白對照組的肝臟區(qū)域均細(xì)胞完整，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核呈規(guī)則圓形，見空白組圖1.A，2.A所示;而在藥物暴露處理組中，成魚肝組織肝細(xì)胞排列松散，萎縮變形，細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)溶解，空泡化嚴(yán)重，部分區(qū)域可見細(xì)胞壞死。見圖1.B。同時，給藥組大鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少，出現(xiàn)萎縮變形，部分區(qū)域可見胞質(zhì)溶解造成空泡化，有出血和凋亡的現(xiàn)象。見圖2.B。

2.2?芫花水提物處理對成魚肝臟及大鼠肝臟生化指標(biāo)水平的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，藥物暴露處理組中斑馬魚成魚肝臟中SOD、SDH及NADH的酶活力均顯著下降（P<0.05），而MDA含量上升（P<0.01）。見圖3。與對照組比較，給藥組大鼠肝臟中SOD和SDH的活力均顯著下降（P<0.05），而MDA、TG含量升高（P<0.01），此外，所有給藥組大鼠血清中AST活力均升高（P<0.01），低劑量給藥組中ALT活力顯著升高（P<0.05）。見圖4。

2.3?芫花水總提物對斑馬魚成魚肝臟毒性相關(guān)基因表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，給藥組中線粒體功能相關(guān)基因mtatp6，mtco1，mtnd1，pklr表達(dá)水平下調(diào)，氧化應(yīng)激相關(guān)基因gstp2，nqo1，sod1的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，自噬相關(guān)基因beclin-1和ATG3表達(dá)水平下調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因包括atf4a，ern1，hsp90b1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖5。

3?討論

芫花在臨床應(yīng)用時常常伴隨著毒性作用和不良反應(yīng)，現(xiàn)有研究表明芫花對肝臟、腎臟、胃腸道等多個臟器存在毒性作用[11]，尤其是肝臟毒性，嚴(yán)重限制了芫花的廣泛應(yīng)用。但是有關(guān)芫花肝毒性研究的報道嚴(yán)重缺乏，亟需對芫花的肝臟毒性和毒性機(jī)制進(jìn)一步評價，以利于芫花的深入開發(fā)和利用。

斑馬魚作為一種新型的模式生物，具有體積小、繁殖周期短、產(chǎn)卵率高、體外受精、基因序列與人類高度相似等優(yōu)點(diǎn)[12-13]，最重要的是，傳統(tǒng)的肝臟毒性檢測指標(biāo)如肝臟代謝功能檢測、組織病理學(xué)檢測、肝臟特異標(biāo)記物表達(dá)檢測和肝細(xì)胞凋亡檢測在斑馬魚模型中也能夠使用，因此，斑馬魚不失為一種良好的肝臟毒性評價的模型。近些年，本課題組已利用斑馬魚進(jìn)行香加皮[14]、芫花、重樓等中藥潛在肝毒性篩選和評價，并致力于建立基于斑馬魚模型的中藥肝毒性評價平臺。但是截止到目前斑馬魚和傳統(tǒng)評價模型在中藥肝毒性評價中是否具有相似性還沒有詳細(xì)報道。

在本研究中，我們利用芫花分別對斑馬魚成魚和SD大鼠進(jìn)行處理，在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，首先通過病理組織切片技術(shù)來確認(rèn)斑馬魚模型與傳統(tǒng)的體內(nèi)SD大鼠模型在肝毒性損傷中表現(xiàn)出相似的肝毒性響應(yīng)。結(jié)果表明芫花藥物處理皆能夠引起斑馬魚模型和SD大鼠肝臟出現(xiàn)顯著的組織結(jié)構(gòu)改變，包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，組織結(jié)構(gòu)紊亂和細(xì)胞空泡化等。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）可以作為診斷肝細(xì)胞受損的標(biāo)準(zhǔn)[15]。前者主要分布于肝細(xì)胞的胞質(zhì)中，后者主要分布于肝細(xì)胞的線粒體內(nèi)。在本研究中，與對照組比較，SD大鼠給藥組中低劑量組大鼠血清中ALT活力顯著性升高，AST活力在所有給藥組大鼠血清中均有所升高（P<0.01），表明芫花水提取物對大鼠肝臟有毒性作用。

同時生化指標(biāo)評價的結(jié)果也表明芫花處理能夠引起2種動物模型肝臟組織中的生化反應(yīng)改變呈現(xiàn)相似性。在正常情況下，機(jī)體處于氧化-抗氧化的動態(tài)平衡中，當(dāng)自由基過多或清除能力下降時，機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能會受到損傷，而脂質(zhì)過氧化過程中會產(chǎn)生多種活性氧自由基，引起機(jī)體的氧化損傷。

SOD是抗氧化系統(tǒng)中的主要抗氧化酶之一，具有清除自由基作用，SOD活力水平體現(xiàn)了機(jī)體抗氧化應(yīng)激水平。MDA是自由基攻擊膜不飽和脂肪酸形成的產(chǎn)物，它的含量多少可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平，也可間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的水平[16]。在本研究中，與對照組比較，芫花處理能夠引起斑馬魚成魚與SD大鼠組肝臟中MDA含量均上升（P<0.01），而SOD活性水平均顯著下降（P<0.05），表明氧化應(yīng)激是芫花水提取物引起肝損傷的主要形式之一。線粒體是三羧酸循環(huán)的主要場所，是細(xì)胞能量產(chǎn)生的中樞，其維持著細(xì)胞正常的生理功能。SDH位于細(xì)胞線粒體內(nèi)膜，是細(xì)胞有氧呼吸的關(guān)鍵酶，為真核細(xì)胞線粒體和多種原核細(xì)胞需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，其活性可作為評價三羧酸循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)[17]。糖酵解途徑是將葡萄糖和糖原降解為丙酮酸并伴隨ATP生成的一系列途徑，產(chǎn)生的丙酮酸將進(jìn)入線粒體繼續(xù)氧化分解，通過三羧酸循環(huán)及電子傳遞鏈徹底氧化成二氧化碳和水，并生成ATP的過程。NADH氧化酶，在糖酵解過程中催化NADH同氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生NAD+，對維持NAD+/NADH的平衡有重要的意義[18]。在本研究中，與對照組比較，芫花能夠引起斑馬魚成魚與SD大鼠組肝臟中SDH含量均顯著下降（P<0.05），同時，芫花能夠引起斑馬魚肝臟中NADH氧化酶含量顯著下降（P<0.05），表明芫花水提取物影響三羧酸循環(huán)和糖酵解過程，進(jìn)而造成線粒體功能損傷。TG是脂質(zhì)的組成成分，其主要功能是供給與儲存能源，正常情況下三酰甘油保持動態(tài)平衡，TG含量升高可以作為肝臟細(xì)胞中的三酰甘油代謝出現(xiàn)障礙的標(biāo)志。在本研究中，與對照組比較，SD大鼠給藥組中TG含量升高（P<0.01），表明脂質(zhì)代謝障礙是芫花水提取物引起肝損傷的方式之一。

為了進(jìn)一步闡明芫花水提取物引起肝損傷的作用機(jī)制，本研究還檢測了氧化應(yīng)激、線粒體功能相關(guān)基因的表達(dá)水平。Gstp2是胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）家族成員之一，具有緩解內(nèi)源性、外源性物質(zhì)的毒性的作用[19]，其表達(dá)水平的降低暗示機(jī)體內(nèi)抗氧化物解毒能力的下降。nqo1酶屬于Ⅱ相代謝酶，在體內(nèi)與其他Ⅰ、Ⅱ相代謝酶一起構(gòu)成了體內(nèi)對外源性毒性物質(zhì)的代謝網(wǎng)絡(luò)，在機(jī)體的解毒代謝過程中發(fā)生雙電子氧化還原反應(yīng)[20]。SOD1是一種在線粒體外發(fā)揮抗氧化作用的抗氧化酶[21]，通過催化超氧陰離子自由基（O22-）歧化為H2O2和O2來維持胞內(nèi)活性氧物種（ROS）的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[22]。本研究結(jié)果顯示芫花水提取物誘導(dǎo)的斑馬魚成魚肝臟中g(shù)stp2，nqo1，SOD1基因的表達(dá)均下調(diào)，表明給藥后，機(jī)體內(nèi)的ROS增多，導(dǎo)致斑馬魚體內(nèi)的氧化和抗氧化作用失衡，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷發(fā)生。

Pklr基因作為糖酵解相關(guān)基因，其表達(dá)水平下調(diào)可以顯示糖酵解過程受抑制，進(jìn)而影響線粒體產(chǎn)能。細(xì)胞色素c氧化酶是有氧代謝中的關(guān)鍵酶，若該酶缺乏、缺乏或功能失調(diào)，將會導(dǎo)致線粒體氧化活性受損和一些嚴(yán)重的疾病狀態(tài)[23]。mtco1為線粒體呼吸鏈末端細(xì)胞色素c氧化酶構(gòu)造中的一個亞基，能夠編碼細(xì)胞色素c氧化酶Ⅰ。mtnd1基因能夠編碼NADH脫氫酶1的蛋白質(zhì)的合成，該蛋白質(zhì)為復(fù)合物Ⅰ的一部分，在線粒體中具有重要活性，能夠參與氧化磷酸化的過程。同樣，mtATP6基因能夠編碼ATP合酶的Fo亞基6，也參與氧化磷酸化的過程與ATP的生成密切相關(guān)?？梢?，Pklr基因、mtco1基因、mtnd1基因、mtATP6基因表達(dá)水平高低可以作為線粒體功能強(qiáng)弱的依據(jù)。本研究結(jié)果顯示芫花水提取物誘導(dǎo)的斑馬魚成魚肝臟中pklr，mtco1，mtnd1，mtatp6基因的表達(dá)均顯著性下調(diào)，表明芫花水提取物能夠?qū)е聶C(jī)體內(nèi)的三羧酸循環(huán)和糖酵解障礙，進(jìn)而造成線粒體功能損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic Reticulum，ER）是蛋白質(zhì)合成的主要場所，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外應(yīng)激因子影響蛋白正確折疊以及鈣的儲存，或未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集時，會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）[24]。ERS的相關(guān)基因有atf4a，hsp90b1，ern1，在芫花水提取物的誘導(dǎo)下，成魚中atf4a，hsp90b1的表達(dá)上調(diào)，ern1基因的表達(dá)下降，說明芫花水提取物對成魚肝臟產(chǎn)生毒性作用時，其作用機(jī)制均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用相關(guān)。

綜上可以看出，芫花水提取物能夠引起斑馬魚成魚和SD大鼠出現(xiàn)明顯的肝毒性。本研究發(fā)現(xiàn)芫花水提取物造成肝臟損傷的潛在作用機(jī)制與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞自噬有關(guān)，為后續(xù)研究者進(jìn)行芫花的肝毒性機(jī)制研究提供思路。另外研究表明斑馬魚成魚與SD大鼠在芫花肝毒性相應(yīng)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的一致性。斑馬魚模型具有成本低、繁殖快、易飼養(yǎng)、高通量篩選等優(yōu)勢，因此，斑馬魚作為模式生物用于中藥肝毒性評價具有可行性、高效性，為未來建立斑馬魚中藥肝臟快速評價技術(shù)與方法提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：159.

[2]李玲芝，宋少江，高品一.芫花的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2007，24（9）：587-592.

[3]Song Z，Zhang Y，Zhang H，et al.Isoliquiritigenin triggers developmental toxicity and oxidative stress-mediated apoptosis in zebrafish embryos/larvae via Nrf2-HO1/JNK-ERK/mitochondrion pathway[J].Chemosphere，2020，246：125727.

[4]Garcia G R，Noyes P D，Tanguay R L.Advancements in zebrafish applications for 21st century toxicology[J].Pharmacol.Ther.，2016，161：11-21.

[5]Jia Z，Zhao C，Wang M，et al.Hepatotoxicity assessment of Rhizoma Paridis in adult zebrafish through proteomes and metabolome[J].Biomed.Pharmacother.，2020，121：109558.

[6]Zhao C，Jia Z，Li E，et al.Hepatotoxicity evaluation of Euphorbia kansui on zebrafish larvae in vivo[J].Phytomedicine，2019，62：152959.

[7]趙崇軍，田敬歡，倪媛媛，等.馬錢子對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34（11）：2773-2775.

[8]倪媛媛，趙崇軍，馮婭茹，等.基于斑馬魚模型探討馬錢子的抗血管生成活性[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（9）：1534-1538.

[9]李二文，趙崇軍，馮丹，等.芫花水提取物對斑馬魚肝臟的毒性作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（4）：453-456.

[10]Westerf Ield M.The Zebrafish Book[M].Eugene：University of Oregon Press，1995：30-43.

[11]Zhou Q，Xiao L，Liu Q，et al.Vinegar processing attenuates toxicity on IEC-6 cells caused by chloroform extraction of Daphne genkwa[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2018，43（11）：2282-2287.

[12]王新娟.斑馬魚作為肝癌模型的應(yīng)用進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志，2016，32（7）：1425-1428.

[13]趙崇軍，田敬歡，王金鳳，等.斑馬魚在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中草藥，2015，46（17）：2635-2648.

[14]代一航，趙崇軍，田敬歡，等.香加皮水提取物對斑馬魚幼魚肝臟毒性的初步研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2017，10（10）：7-12.

[15]Zhang Y，Liu K，Hassan H M，et al.Liver Fatty Acid Binding Protein Deficiency Provokes Oxidative Stress，Inflammation，and Apoptosis-Mediated Hepatotoxicity Induced by Pyrazinamide in Zebrafish Larvae[J].Antimicrob.Agents Chemother.，2016，60（12）：7347-7356.

[16]沈洪艷，焦曉會，武彤.頭孢噻肟鈉對斑馬魚SOD活性、MDA含量及DNA損傷的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2015，35（8）：2626-2632.

[17]高峰，焦晨莉，余金花，等.基于“有故無隕”理論探討何首烏對腎陰虛大鼠肝線粒體能量代謝的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（11）：385-388.

[18]Ge X，Shi X，Shi L，et al.Involvement of NADH Oxidase in Biofilm Formation in Streptococcus sanguinis[J].PLoS One，2016，11（3）：e0151142.

[19]Glisic B，Mihaljevic I，Popovic M，et al.Characterization of glutathione-S-transferases in zebrafish（Danio rerio）[J].Aquat.Toxicol.，2015，158：50-62.

[20]Dinkova-Kostova A T，Talalay P.Persuasive evidence that quinone reductase type 1（DT-diaphorase）protects cells against the toxicity of electrophiles and reactive forms of oxygen[J].Free Radic.Biol.Med.，2000，29（3-4）：231-240.

[21]Yin J，Wang A，Li W，et al.Sensitive biomarkers identification for differentiating Cd and Pb induced toxicity on zebrafish embryos[J].Environ.Toxicol.Pharmacol.，2017，56：340-349.

[22]李享，石家愿，邱爽，等.SOD1抑制與活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控[J].化學(xué)進(jìn)展，2018，30（10）：1475-1486.

[23]Ostrow J Donald，Irwanto K Astrid，Malik Safarina G，et al.Effect of bilirubin on cytochrome c oxidase activity of mitochondria from mouse brain and liver[J].BMC Res.Notes.2010，3（1）：162.

[24]Guzel E，Arlier S，Guzeloglu-Kayisli O，et al.Endoplasmic Reticulum Stress and Homeostasis in Reproductive Physiology and Pathology[J].Int.J.Mol.Sci，2017，18（4）：792.

（2020-06-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）