林蒙蒙 李喜梅 徐 峰

浙江省溫州市中心醫(yī)院(325000)

妊娠期糖尿病(GDM)早產(chǎn)是妊娠期孕婦出現(xiàn)糖代謝異常而導(dǎo)致[1-3]。有研究表明環(huán)狀RNA Amotl-1的表達(dá)與GDM孕婦早產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)，且內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞(ECFCs)與環(huán)狀RNA Amotl-1的表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)。探討環(huán)狀RNA Amotl-1表達(dá)和內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞影響GDM孕婦早產(chǎn)發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，可為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年9月—2018年9月本院確診為GDM早產(chǎn)孕婦60例作為觀(guān)察組，按年齡構(gòu)成與之匹配健康妊娠期志愿者10例作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝炎病毒及人類(lèi)免疫缺陷病毒感染；②自身免疫性疾?。虎燮渌麗盒阅[瘤；④各種精神疾患。研究對(duì)象及家屬均充分告知研究過(guò)程并簽署知情同意書(shū)。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核。患者均遵醫(yī)囑使用降糖藥物，低糖低脂飲食，適當(dāng)鍛煉，及時(shí)反饋不良反應(yīng)。

1.2 研究方法

1.2.1監(jiān)測(cè)血糖妊娠末期檢測(cè)空腹血糖(FPG)、餐后2 h血糖(2hPBG)及血漿糖化血紅蛋白(HbA1c)含量。

1.2.2內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞血樣計(jì)數(shù)收集研究對(duì)象早產(chǎn)14天內(nèi)2次血液標(biāo)本，多參數(shù)流式細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞。

1.2.3人內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞株解凍并擴(kuò)增與培養(yǎng)人內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞株復(fù)蘇后在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。每1～2天換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4siRNA設(shè)計(jì)及合成根據(jù)Gene Bank中提供的RNA-環(huán)狀RNA Amotl-1序列，通過(guò)Ambion公司的在線(xiàn)設(shè)計(jì)工具，去除同源序列，設(shè)計(jì)3條針對(duì)RNA-環(huán)狀RNA Amotl-1的特異性si RNA及1條與目的基因無(wú)同源性的對(duì)照序列。在劃痕實(shí)驗(yàn)和小管形成實(shí)驗(yàn)中，選擇一條最佳的環(huán)狀RNA Amotl-1-si RNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5小管形成實(shí)驗(yàn)將RNA-環(huán)狀RNA Amotl-1的特異性si RNA轉(zhuǎn)染分為一組，將RNA-環(huán)狀RNA Amotl-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分為一組，另一組設(shè)為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞提前1天用EBM-2+2%FBS青霉素/鏈霉素預(yù)處理，次日胰酶消化后每孔接種17000個(gè)細(xì)胞，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加100μl EBM-2+2%FBS+1%青霉素鏈霉素孵育培養(yǎng)14h后拍照。實(shí)驗(yàn)組加10nM維生素D3，對(duì)照組加入相應(yīng)濃度乙醇。用Image J軟件測(cè)量形成的小管總長(zhǎng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.2.6細(xì)胞劃痕平面遷移實(shí)驗(yàn)將RNA-環(huán)狀RNA Amotl-1的特異性si RNA轉(zhuǎn)染分為一組，將RNA-環(huán)狀RNA Amotl-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分為一組，另一組設(shè)為空白對(duì)照組。內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞接種于玻片，常規(guī)培養(yǎng)后，無(wú)菌Eppendorf Tip在玻片上劃出直徑3 mm直線(xiàn)劃痕。PBS緩沖液反復(fù)沖洗刮下的細(xì)胞，置玻片后培養(yǎng)箱孵育24 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 觀(guān)察組一般情況

觀(guān)察組FPG(4.38±0.57)mmol/L，2hPBG(6.47±0.54)mmol/L，HbA1c(6.26±0.46)%。60例胎兒中，出現(xiàn)1例宮內(nèi)窘迫、1例巨大兒、2例低體重兒和1例新生兒窒息，無(wú)低血糖新生兒。

2.2 內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞比例

觀(guān)察組內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞數(shù)目(99.2%)高于對(duì)照組(35.7%)(P<0.05)。

2.3 環(huán)狀RNA Amotl-1的表達(dá)與內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞關(guān)系

2.3.1人內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)能力si RNA轉(zhuǎn)染組、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組小管長(zhǎng)度分別為(105.17±1.34)μm、(151.62±2.51)μm和(98.56±3.71)μm有差異(P<0.05)(封三圖1)。

2.3.2細(xì)胞劃痕平面遷移實(shí)驗(yàn)24h后遷移率，對(duì)照組為5.2%，RNA-環(huán)狀RNA Amotl-1質(zhì)粒傷口基本愈合近100%，其次是特異性si RNA(55.9%)，各組存在差異(P<0.05)(封三圖2)。

3 討論

妊娠期糖尿病使孕婦的糖耐量受損。最新流行病學(xué)研究表明，亞洲國(guó)家GDM患病率為3.0%～21.2%[4]。隨著肥胖和產(chǎn)婦年齡的增加，GDM的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，也增加不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)。內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞是一種有別于經(jīng)典內(nèi)皮祖細(xì)胞而具有強(qiáng)大血管新生功能的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞[5-7]，在心、肺、腦的缺血修復(fù)中具有強(qiáng)大的血管生成潛能，與GDM孕婦早產(chǎn)關(guān)系密切。有文獻(xiàn)指出GDM導(dǎo)致子宮內(nèi)高糖環(huán)境、內(nèi)皮功能紊亂從而誘發(fā)早產(chǎn)、子癇前期、死產(chǎn)、新生兒死亡和先天缺陷等孕期不良結(jié)局[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)GDM孕婦的內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞數(shù)目高于非GDM的正常孕婦，分析認(rèn)為ECFCs數(shù)目過(guò)高可能引發(fā)GDM孕婦早產(chǎn)，ECFCs可能參與了GDM孕婦早產(chǎn)的發(fā)生和發(fā)展。

環(huán)狀RNA(circRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[10-12]，并參與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病等多種疾病的發(fā)病機(jī)制[13-14]。Yan等人[15]發(fā)現(xiàn)GDM患者胎盤(pán)組織中circRNA表達(dá)異常，在GDM的發(fā)生過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。有報(bào)道稱(chēng)，circRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)狀RNA Amotl-l加速傷口愈合[16]，所以環(huán)狀RNA Amotl-l與內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞的增長(zhǎng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示，內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞數(shù)目過(guò)高可能引發(fā)GDM孕婦早產(chǎn)，circRNA可能通過(guò)抑制、緩沖和釋放環(huán)狀RNA Amotl-1，而影響內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞的增長(zhǎng)速度而使早產(chǎn)發(fā)生。本研究通過(guò)環(huán)狀RNA Amotl-l的si RNA以及環(huán)狀RNA Amotl-l質(zhì)粒的合成，利用細(xì)胞劃痕平面遷移實(shí)驗(yàn)和小管形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA Amotl-1可明顯促進(jìn)內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞生長(zhǎng)，表明內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞的增長(zhǎng)與環(huán)狀RNA Amotl-l水平的提高有關(guān)，GDM孕婦體內(nèi)內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞的高水平表達(dá)也受到環(huán)狀RNA Amotl-1水平的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA Amotl-1作用機(jī)制不僅包括原位調(diào)控，還存在遠(yuǎn)程調(diào)控機(jī)制[17]，它的遠(yuǎn)程調(diào)控機(jī)制在真核生物體內(nèi)廣泛存在，其多樣的作用方式形成了對(duì)靶基因的復(fù)雜的調(diào)控通路。因此環(huán)狀RNA Amotl-1在GDM孕婦早產(chǎn)中很可能存在遠(yuǎn)程調(diào)控機(jī)制，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞，介導(dǎo)GDM孕婦早產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA Amotl-1能明顯促進(jìn)內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而調(diào)控GDM孕婦早產(chǎn)的發(fā)生和發(fā)展，為臨床治療GDM提供新的靶點(diǎn)。