張振 羅輝宇 曾煉

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis, OA）作為一種慢性的關(guān)節(jié)退行性病變，其主要的病理改變是關(guān)節(jié)軟骨損傷［1］。軟骨細胞作為關(guān)節(jié)軟骨的主要成分，參與了骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的全過程［2］。因此體外關(guān)節(jié)軟骨細胞的培養(yǎng)是模擬軟骨損傷的基礎(chǔ)。然而目前關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離培養(yǎng)存在著操作步驟繁瑣，細胞生物學(xué)特性難以持續(xù)保持以及經(jīng)費投入較大等一系列的問題［3］。

Ⅱ型膠原是由具有三重螺旋結(jié)構(gòu)的三個相同鏈構(gòu)成的膠原纖維，通過分子間的相互交聯(lián)而形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以抵抗細胞外基質(zhì)中陰離子蛋白多糖聚合時所產(chǎn)生的腫脹壓力，進一步保證關(guān)節(jié)軟骨的完整性［4］。有研究表明退化的關(guān)節(jié)軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達量顯著降低，同時證明了軟骨細胞活力隨Ⅱ型膠原表達的降低而逐漸下降［5］。在骨性關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，90%～95%Ⅱ型膠原組成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的損傷可能是引起關(guān)節(jié)炎病變的扳機點［6］。正常的軟骨細胞細胞外基質(zhì)是由Ⅱ型膠原和蛋白聚糖構(gòu)成，為維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，細胞外基質(zhì)的成分通過含血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶5（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5, ADAMTS5）不斷更新與重塑，但當(dāng)細胞退化或損傷時，ADAMTS5 的表達量會不斷增加，導(dǎo)致合成與降解的失衡，故而ADAMTS5可以作為評價軟骨細胞功能活性的關(guān)鍵性指標(biāo)［7?9］。

本課題組采用機械分離聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化的方法處理SD大鼠幼鼠和新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織，測定不同代數(shù)的軟骨細胞Ⅱ型膠原與ADAMTS5表達水平，觀察并比較兩種軟骨細胞的培養(yǎng)特點。

材料與方法

一、實驗主要試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國)、胰蛋白酶（Gibco，美國）、Ⅱ型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司，中國）、胎牛血清（FBS，Hyclone，南美）、臺盼藍（Sigma，美國）、甲苯胺藍（Sigma，美國）、Ⅱ型膠原多克隆抗體（Abcam，美國）、Alexa Fluor 山羊抗鼠二抗（碧云天有限公司，中國）、Tizol 試劑盒（Invitrogen，德國）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，美國）、SYBR Green qPCR試劑盒（Promega，美國）；熒光倒置顯微鏡（OLYM?PUS，日本）、NanoPhotometer（Implen，德國）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，美國）、低溫臺式離心機（Eppen?dorf，德國）、生物安全柜（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，中國）。

二、實驗動物

10只出生2周、體重為10～14 g的SD大鼠幼鼠，2只出生4周、體重為400～450 g的新西蘭兔，兩者均雌雄各半，實驗動物均來源于湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心［動物生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2016?0008；動物使用許可證：SYXK（鄂）2016?0031］，動物實驗方案經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)意見》。

三、軟骨細胞分離培養(yǎng)及觀察

（一）SD大鼠幼鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞分離培養(yǎng)

選取2周齡的SD大鼠幼鼠10只，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后處死，消毒皮膚。無菌條件下剪開雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，離斷含有軟骨組織的部位，置于盛有磷酸鹽緩沖液（PBS）的培養(yǎng)皿中。用含青/鏈霉素雙抗液的PBS沖洗2～3次，清除表面血污；用眼科剪及鑷子逐層分離肌肉組織、骨性成分、軟骨骨膜，僅保留透明軟骨。分離所得軟骨組織用PBS再次沖洗3～4 次后，移入生物安全柜，將軟骨組織剪碎至1 mm3的大小，裝入培養(yǎng)瓶，加入濃度為0.2%的Ⅱ型膠原酶，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中消化1 h后，倒置顯微鏡觀察，可見大量的軟骨細胞和細胞外基質(zhì)成分。機械吹打30 s 后，將細胞與未完全消化的軟骨組織分離，靜置5 min后，吸取上清液于15 ml離心管中，低溫離心（1 500 rpm，10 min）。離心后所得的上清液重新加入培養(yǎng)瓶中。消化剩余的軟骨組織分別于2 h、4 h后再次收集，用FBS體積分數(shù)為10%的DMEM 培養(yǎng)基重懸離心后沉淀的軟骨細胞，輕輕吹打，使細胞懸液均勻分布，然后經(jīng)300目不銹鋼濾網(wǎng)過濾收獲單細胞懸液，接種至10 ml培養(yǎng)瓶中置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d 換一次液，倒置顯微鏡觀察并攝像。

（二）新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞分離培養(yǎng)

選取4周齡新西蘭兔2只，耳緣靜脈注射空氣處死，去皮消毒，無菌條件下分離兩側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨，置于盛有PBS 培養(yǎng)皿中清洗表面血跡，后移入生物安全柜剪碎軟骨組織至1 mm3大小裝入培養(yǎng)瓶中，加入濃度為0.2%的Ⅱ型膠原酶消化2 h，顯微鏡觀察，明顯觀察到大量軟骨細胞分布于軟骨組織周圍，機械吹打30 s 后，將細胞與未消化的組織分開，靜置5 min 后，吸取上清液于15 ml 離心管中，低溫離心（1 500 rpm，10 min），棄上清，加入含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸，經(jīng)300 目不銹鋼濾網(wǎng)制成單細胞懸液，接種于10 ml 培養(yǎng)瓶中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察并攝像。

四、軟骨細胞傳代培養(yǎng)

5 d 后軟骨細胞融合成片，排列成“鋪路石”狀，生長面積達培養(yǎng)瓶的80%～90%。棄去舊的培養(yǎng)液，用PBS液清洗3次，加入濃度為0.25%的胰蛋白酶置于恒溫箱消化1～2 min 后，鏡下觀察貼壁細胞變得透亮，成圓形，個別細胞甚至漂浮，立即加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻，離心（1 000 rpm，3 min），棄上清，加入新的培養(yǎng)基重懸混勻，接種培養(yǎng)，按照1∶2比例傳代，置于恒溫箱培養(yǎng)。

五、細胞計數(shù)法測定軟骨細胞生長曲線

用濃度為0.25%的胰酶消化原代培養(yǎng)的大鼠及兔軟骨細胞，按照1×108/L 的相同密度接種于48 孔板，分9 組，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，2 d 換液一次。從細胞培養(yǎng)的第2 天開始連續(xù)9 d，每天收集細胞，利用血球計數(shù)板進行計數(shù)，每個復(fù)孔計數(shù)2次，取細胞數(shù)的平均值作為結(jié)果，以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)（對數(shù)）為縱軸，利用GraphPad Prism（Prism5,San Diego,美國）繪制大鼠軟骨細胞的生長曲線。

六、實時定量PCR 測定軟骨細胞中CollagenⅡ及ADAMTS5 mRNA的表達

取1?5 代培養(yǎng)的大鼠及兔軟骨細胞，按照1×105/ml 的密度接種于6 孔板中，待培養(yǎng)48 h 后，每孔加入1 ml Trizol 裂解細胞。根據(jù)試劑說明書，提取總RNA，并使用NanoPhotometer 對RNA 進行定量。取2 μg 總RNA 通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)為cDNA，使用SYBR Green熒光染料進行qPCR，過程如下：反應(yīng)混合物包括4 μl cDNA 模板，10 μl GoTaq?qPCR Master Mix（Promega，美國），以及引物0.4 μl和5.2 μl無核酶水。程序設(shè)置包括95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，設(shè)置40 個循環(huán)，以GAPDH 作為內(nèi)參（表1），計算各組中CollagenⅡ及ADAMTS5的mRNA相對表達。

表1 大鼠及新西蘭兔GAPDH、CollagenⅡ、ADAMTS5 基因序列

七、甲苯胺藍染色

取第2 代軟骨細胞按照1×108/L 的密度接種于12 孔板中，細胞培養(yǎng)2 d 后，融合面積達60%～70%。去除原培養(yǎng)液，用冰的PBS 沖洗2～3 次，加入體積分數(shù)為4%的多聚甲醛4 ℃固定2 h，去離子水沖洗5 min，加入質(zhì)量分數(shù)為1%的甲苯胺藍染色液2 ml，置于搖床常溫浸染1～2 h，去原液，無水乙醇脫色，去離子水終止，倒置顯微鏡觀察、攝像。

八、Ⅱ型膠原的免疫熒光染色

取第2 代的軟骨細胞按照1×108/L 的密度接種于12孔板中，待細胞正常貼壁后，棄去原液，用PBS緩沖液漂洗3 min；加入體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗3 min；再加入質(zhì)量分數(shù)為0.5%的TritonX?100 室溫透膜20 min，隨后再用PBS潤洗3 次，每次靜置5 min，棄去PBS，加入體積分數(shù)為10%的脫脂牛奶室溫封閉30 min，吸去封閉液，加入足量的一抗4 ℃孵育過夜；第2 天回收一抗后用PBS潤洗3次，每次靜置5 min，避光滴加稀釋好的熒光二抗（稀釋比1∶100），常溫避光孵育1 h，PBS 漂洗3 min；加入DAPI 避光孵育5 min 復(fù)染核，PBS 漂洗5次，每次4 min，洗去多余的DAPI染液，封固，熒光顯微鏡觀察并攝像。

九、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件（IBM公司，美國）進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細胞形態(tài)的比較

倒置顯微鏡觀察原代分離培養(yǎng)出的大鼠軟骨細胞貼壁前成圓形，漂浮于培養(yǎng)基中，細胞形態(tài)較小。培養(yǎng)6～12 h 后細胞貼壁，折光性高呈透亮狀態(tài)，胞核為橢圓形，位于胞體中央，胞質(zhì)豐富。24 h后大多數(shù)細胞完成貼壁，部分細胞逐漸伸展，形狀發(fā)生改變，變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形，散在均勻分布于培養(yǎng)基中（見圖1 a），培養(yǎng)3 d 后，細胞增殖明顯，融合面積約占瓶底的60%，相鄰細胞間出現(xiàn)結(jié)節(jié)狀的連接，周圍伴有基質(zhì)成分的沉積（見圖1 b）。1周后，細胞鋪滿瓶底進行傳代培養(yǎng)，傳代后細胞貼壁時間明顯縮短，增殖速度加快，約4 d左右的時間基本鋪滿。

圖1 大鼠軟骨細胞培養(yǎng)不同時間在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài) a：培養(yǎng)1 d（×100）；b：培養(yǎng)3 d（×100）；c：培養(yǎng)1 d（×200）；d：培養(yǎng)3 d（×200）

與大鼠軟骨細胞相比，原代培養(yǎng)的兔軟骨細胞貼壁時間明顯延長約12～24 h，其中大部分的細胞24 h 后才開始貼壁，貼壁的細胞多為三角形或不規(guī)則形，形態(tài)較大，胞質(zhì)成分較多，核仁明顯。細胞增殖相對緩慢且具有成簇生長的特點，約2 周左右才鋪滿瓶底（見圖2 b）。

圖2 大鼠軟骨細胞與兔軟骨細胞形態(tài)學(xué)比較 a：大鼠軟骨細胞（×200）；b：兔軟骨細胞（×200）

二、軟骨細胞生長曲線

原代大鼠軟骨細胞接種后前2 d生長緩慢，細胞分裂增殖較少，處于細胞生長周期的潛伏期，第3天起細胞分裂增殖加速，構(gòu)成生長曲線的對數(shù)增長期，直到第5 天后生長曲線逐漸趨于平穩(wěn)達平臺期；兔軟骨細胞增殖明顯滯后，生長曲線右移，其增殖高峰約第7天才出現(xiàn)（見圖3）。

圖3 大鼠軟骨細胞與兔軟骨細胞生長曲線的比較

三、不同代數(shù)軟骨細胞Collagen Ⅱ、ADAMTS5 mRNA水平的比較

Collagen Ⅱ、ADAMTS5 表達水平可以代表軟骨細胞活力的高低，通過比較不同代數(shù)的同種軟骨細胞Collagen Ⅱ的表達水平發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，Collagen Ⅱ的mRNA 表達水平逐漸降低，AD?AMTS5的mRNA 表達水平逐步升高，表明軟骨細胞的活力逐漸降低，逐步退化；進一步比較了相同代數(shù)的不同軟骨細胞上述指標(biāo)的表達差異，可以明顯觀察到大鼠軟骨細胞較兔軟骨細胞具有更好的活力，即Collagen Ⅱ水平更高而ADAMTS5 水平更低（見圖4）。

圖4 不同代數(shù)大鼠及兔軟骨細胞Collagen Ⅱ及ADAMTS5 mRNA表達水平 a：大鼠及兔軟骨細胞Collagen ⅡmRNA表達；b：大鼠及兔軟骨細胞ADAMTS5 mRNA表達

四、軟骨細胞的鑒定

（一）甲苯胺藍染色

甲苯胺藍染色可見大鼠軟骨細胞胞質(zhì)內(nèi)存在藍色異染顆粒，表明軟骨細胞分泌了糖胺多糖（圖5）。

圖5 大鼠軟骨細胞形態(tài)學(xué)鑒定 a：×100；b：×200

（二）Ⅱ型膠原免疫熒光染色

Ⅱ型膠原免疫熒光染色在不同波段的熒光激發(fā)下，大鼠軟骨細胞胞膜及胞質(zhì)呈現(xiàn)出清晰的綠色熒光表現(xiàn)為強陽性，兔軟骨細胞呈現(xiàn)出強烈的紅色熒光，細胞核為明亮藍色，證實原代分離培養(yǎng)的軟骨胞具有分泌Ⅱ型膠原的能力且分泌的膠原成分主要位于胞漿中［10］（見圖6）。

討 論

一、軟骨細胞分離培養(yǎng)方法的改良

傳統(tǒng)方法上選擇成年或胎鼠進行實驗，所收獲的軟骨細胞活性較差且數(shù)量較少。本研究選用出生2周的幼鼠，克服了鼠齡過小，軟骨成分含量較少的缺點，又盡量地減少了其他骨質(zhì)成分的干擾。傳統(tǒng)方法往往采用胰蛋白酶與Ⅱ型膠原酶消化法反復(fù)循環(huán)消化和離心獲取軟骨細胞，步驟相對復(fù)雜，細胞容易受損，活力差且容易發(fā)生污染［11?12］。實驗改良技術(shù)單用Ⅱ型膠原酶進行消化，且突出機械分離的作用，縮短酶消化的時間，逐層機械分離，盡可能去除其他成分，有助于提高細胞純度。分離后軟骨塊剪碎，增加與酶的接觸面積，縮短酶的消化時間，獲取具有高度活性的軟骨細胞。酶消化后，分時間段收集，提高細胞獲取量。收集過程中采用機械吹打，每次至少吹打2～3 min 有助于分離細胞與細胞外基質(zhì)成分，濾網(wǎng)過濾后離心獲取單細胞懸液。

二、大鼠軟骨細胞和兔軟骨細胞的分離培養(yǎng)

（一）選材比較

大鼠軟骨組織和兔相比價格低廉，取材容易。選用出生兩周的幼鼠，軟骨成分相對較多，利用機械分離和Ⅱ型膠原酶消化后，可以極大地增加軟骨細胞獲取率；同時大鼠軟骨組織細胞外基質(zhì)成分含量相對較少，酶消化時間相應(yīng)縮短，因此細胞的活性相對較高。

（二）培養(yǎng)比較

大鼠軟骨細胞培養(yǎng)周期短，培養(yǎng)條件相對簡單，經(jīng)一個星期左右的時間就可以長滿瓶底；反復(fù)傳代培養(yǎng)后，細胞依然保持高度活性，細胞形態(tài)和原代細胞差異不大，而兔軟骨細胞在傳代培養(yǎng)五代及以上后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞活性明顯下降，逐漸走向衰老的進程甚至部分發(fā)生了分化，失去了軟骨特征［13?14］。進一步通過比較不同代數(shù)的軟骨細胞標(biāo)志性蛋白Collagen Ⅱ及ADAMTS5 mRNA 的表達水平，發(fā)現(xiàn)其表達特點與文獻中介紹的一致［6］，也與形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化一致，即隨著傳代次數(shù)的增加，細胞中Collagen ⅡmRNA 表達量逐漸降低，ADAMTS5 mRNA表達量逐漸升高，軟骨特性逐漸減弱。

三、軟骨細胞的培養(yǎng)與鑒定

圖6 軟骨細胞的Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定 a～c：（DAPI, Collagen Ⅱ, Merge），大鼠軟骨細胞；d～f：（DAPI, Collagen Ⅱ, Merge），兔軟骨細胞

軟骨細胞在體外的環(huán)境下，經(jīng)過長期培養(yǎng)和反復(fù)傳代容易出現(xiàn)分化不穩(wěn)定的情況，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維樣細胞，失去表達Ⅱ型膠原的能力［15］。在培養(yǎng)的過程中，需要注意細胞接種的密度。低密度培養(yǎng)時，細胞易與基質(zhì)失去聯(lián)系，細胞因子無法提供反饋調(diào)節(jié)，出現(xiàn)反分化呈成纖維樣細胞形態(tài)，導(dǎo)致合成Ⅱ型膠原的能力下降；高密度培養(yǎng)時細胞生長良好，有助于分泌因子維持其基本表型以及細胞新陳代謝，阻止和減緩細胞的反分化［16］。軟骨細胞無特異性標(biāo)志物，通過對其分泌的氨基多糖的甲苯胺藍染色以及Ⅱ型膠原的免疫熒光染色，結(jié)合取材部位和培養(yǎng)觀察可以鑒別［17?18］。實驗中觀察到經(jīng)甲苯胺藍染色的軟骨細胞胞質(zhì)內(nèi)形成藍色的異染顆粒表明氨基多糖成分的存在；Ⅱ型膠原免疫熒光染色通過抗原-抗體反應(yīng)檢測Ⅱ型膠原表達情況，結(jié)果顯示細胞胞漿中呈現(xiàn)出強熒光信號，表明分離得到是能夠分泌Ⅱ型膠原的軟骨細胞［19］。

四、本研究的技術(shù)改良、不足及展望

本研究立足于比較大鼠及新西蘭兔軟骨細胞的培養(yǎng)以及生物學(xué)特性，重點關(guān)注兩種動物相同取材部位的軟骨細胞形態(tài)學(xué)特點、生長周期以及生物活性，發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)代數(shù)的增加，軟骨細胞增殖能力逐漸下降，同時代表活性的Ⅱ型膠原的表達量也是逐漸降低，進一步說明了培養(yǎng)代數(shù)是制約軟骨細胞活力的主要因素，同時發(fā)現(xiàn)大鼠軟骨細胞相較于相同代數(shù)的兔軟骨細胞活力較強，從而為軟骨材料研發(fā)提供一定參考。但本研究也存在一定的缺陷，本研究僅僅停留在對于兩類軟骨細胞形態(tài)及分泌方面的研究，而對于兩者的超微結(jié)構(gòu)是否存在差異并未涉及，后續(xù)將通過電子顯微鏡進一步比較不同代數(shù)、不同來源的軟骨細胞的結(jié)構(gòu)差異，從而為揭示軟骨老化提供理論依據(jù)。