吳永勝， 徐麒麟， 楊家棣， 羅紅瓊， 楊 雪， 邱時(shí)秀， 孫越鴻， 曹雨辰， 齊桂蘭*

（1.成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川成都 611130；3.樂至縣蠶桑局，四川樂至 641500）

蚯蚓又名地龍，為環(huán)節(jié)動(dòng)物門寡毛綱的陸棲無脊椎動(dòng)物，是我國常用中草藥之一。近些年，蚯蚓提取物（液）越來越受到關(guān)注，其富含多種活性成分如蚓激酶、抗菌肽、蚯蚓素等，具有促生長、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抑菌、抗癌等多種功效 （吳澤宇，2015）。研究發(fā)現(xiàn)飲水中添加稀釋300倍的蚯蚓提取物可以提高伊莎佛黑雞育成期的體液免疫水平（李娟，2018）。蚯蚓提取物可提高小鼠的生長性能，降低料重比，提高血清中 T-AOC、IgG、IFN-γ、IL-6、TNF-α、溶菌酶水平，進(jìn)而提高小鼠的免疫功能（劉瀚揚(yáng)，2019）。飼糧中添加蚯蚓提取物可以降低成華豬的料重比，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成及利用，降低血清LDH和促炎因子IL-6水平，進(jìn)而提高機(jī)體的抗氧化能力和免疫功能（徐麒麟，2019）。

家蠶（Bombyx mori）是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，為絲綢產(chǎn)業(yè)提供重要的原料，繭絲產(chǎn)量是蠶業(yè)生產(chǎn)中最關(guān)注的問題（朱巧瑩，2015）。桑是家蠶的主要飼料，家蠶5齡期的食桑量占全齡食桑量的85%（王安皆，2008）。桑葉為家蠶提供生長發(fā)育及絲蛋白合成所需的營養(yǎng)物質(zhì)，越來越多的學(xué)者用中草藥提取液（高玉軍，2018）、殺蟲劑（李二蘭，2016）或重金屬（袁紅霞，2014）等處理桑葉來研究其對家蠶生長發(fā)育、繭絲質(zhì)量的影響，并深入開展相關(guān)機(jī)理研究。然而目前鮮見蚯蚓提取液對家蠶生長發(fā)育及血淋巴氧化指標(biāo)的影響，因此本試驗(yàn)用不同稀釋比例的蚯蚓提取液原液處理桑葉，初步探究其對家蠶生長發(fā)育、蠶繭質(zhì)量、蠶絲品質(zhì)及血淋巴中氧化關(guān)鍵指標(biāo)的影響，旨在為蚯蚓提取液的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)于2018年春季蠶期在成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所進(jìn)行。供試品種為871×872，由樂至縣蠶桑局提供，1～4齡幼蟲常規(guī)桑葉育。

蚯蚓提取液原液由成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所研制，蚯蚓為人工飼養(yǎng)的赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），蚯蚓提取液用蒸餾水混勻，經(jīng)自融水解后制備，經(jīng)檢測分析，所制備的蚯蚓提取液原液密度1.048 g/mL，其中氨基酸總量（17種）5.42%、游離氨基酸2.97%、SOD 1289 IU/mL、小肽6.95%，蚯蚓提取液原液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 苯基硫脲購自Sigma-Aldrich公司，丙二醛、乳酸脫氫酶和總抗氧化能力試劑盒購自北京奇松生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 5齡期家蠶幼蟲隨機(jī)分為4個(gè)組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100頭。設(shè)置3個(gè)蚯蚓提取液原液稀釋比例組（EE1、EE2和 EE3），稀釋比例分別為50倍、100倍和200倍，蚯蚓提取液原液按比例稀釋后按50 mL/kg噴灑新鮮桑葉，稍晾干后給家蠶添食，對照組（CK）則用蒸餾水代替。5齡期家蠶幼蟲饑餓4 h后開始添食，每8 h添食一次，進(jìn)入熟蠶期終止添食，正常條件下上簇營繭。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 家蠶生長指標(biāo) 在家蠶飼養(yǎng)期間，每天觀察各組家蠶的基本活動(dòng)，調(diào)查家蠶的蠶體質(zhì)量及存活率，并及時(shí)將死亡幼蟲移除。

1.4.2 繭質(zhì)及絲質(zhì) 在各組家蠶全部上簇7 d后采繭，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取雌雄繭各10粒，剖繭，分別稱量全繭量、繭層量，計(jì)算繭層率；從各處理組中稱取繅絲測定材料繭1.5 kg，委托四川省農(nóng)科院蠶業(yè)研究所檢測絲質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。

1.4.3 血淋巴氧化指標(biāo) 5齡期第7天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取家蠶幼蟲各10頭，用脫脂棉蘸取75%的酒精對家蠶蠶體進(jìn)行體表消毒，剪去尾角，輕壓腹部采集血淋巴于冰浴的離心管中，加入少量苯基硫脲后4℃、8000 r/min離心10 min，取上清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用ELISA試劑盒檢測家蠶血淋巴中丙二醛、乳酸脫氫酶、總抗氧化能力水平。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)分析軟件中的MEANS過程進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，ANOVA過程進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05表示差異顯著，采用GraphPad Prism6軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 蚯蚓提取液對家蠶體質(zhì)量和存活率的影響由表1可知，與對照組相比，添食蚯蚓提取液稀釋的桑葉可提高家蠶的體質(zhì)量和存活率。50倍稀釋組體質(zhì)量和存活率均顯著高于對照組（P＜0.05），100和200倍稀釋組體質(zhì)量顯著高于對照組（P＜0.05），但存活率與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表1 蚯蚓提取液對家蠶5齡幼蟲體質(zhì)量和存活率的影響

2.2 蚯蚓提取液對家蠶繭質(zhì)的影響 由表2可知，與對照組相比，添食蚯蚓提取液稀釋的桑葉對蠶繭全繭量、繭層量和繭層率無顯著影響（P＞0.05）。

表2 蚯蚓提取液對家蠶5齡幼蟲繭質(zhì)的影響

2.3 蚯蚓提取液對家蠶絲質(zhì)的影響 由表3可知，與對照組相比，添食蚯蚓提取液稀釋的桑葉組蠶絲品質(zhì)均有提高。與對照組相比，50、100和200倍稀釋組粒繭絲長分別增加了68.1、10.9 m和15.1 m；100和200倍稀釋組解舒率分別增加了3.7%和1.9%；50和200倍稀釋組繭絲纖度降低了0.084、0.035旦，100倍稀釋組繭絲纖度增加了0.049旦；50、100和200倍稀釋組解舒絲長分別增加了52.7、46.4 m和31.8 m；50和100倍稀釋組出絲率分別增加了1.6%和1.3%；50、100和200倍稀釋組蠶絲潔凈分別增加了3.12、3.75、1.25 分。

2.4 蚯蚓提取液對家蠶血淋巴氧化指標(biāo)的影響由圖1可知，家蠶5齡期幼蟲添食蚯蚓提取液稀釋后處理的桑葉，血淋巴中氧化關(guān)鍵指標(biāo)丙二醛含量和乳酸脫氫酶含量均有降低。其中，100和200倍稀釋組血淋巴中丙二醛含量與對照組相比分別降低了38.04%和32.23%（P＜0.05），乳酸脫氫酶含量分別降低了25.65%和35.60%（P＜0.05），50倍稀釋組丙二醛和乳酸脫氫酶含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；各稀釋組血淋巴總抗氧化能力差異不顯著（P＞0.05）。

表3 蚯蚓提取液對家蠶絲質(zhì)的影響

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，家蠶5齡幼蟲期添食不同稀釋比例的蚯蚓提取液后，體質(zhì)量、存活率及絲質(zhì)均有所提高，表明蚯蚓提取液可促進(jìn)家蠶的生長發(fā)育。ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，100和200倍蚯蚓提取液稀釋組家蠶血淋巴中氧化損傷指標(biāo)丙二醛和乳酸脫氫酶的水平均有所降低，表明其可以間接提高家蠶的的抗氧化損傷能力。

蚯蚓提取液是從蚯蚓體內(nèi)提取的混合物，研究表明其具有重要的促生長作用，是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。謝大識等（2008）研究發(fā)現(xiàn)日常飲水中添加0.5%和1.5%的蚯蚓提取物后肉雞的增重效果明顯。孫朋朋等（2014）研究表明，仔豬補(bǔ)充料中加入蚯蚓液可促進(jìn)仔豬生長發(fā)育，提高斷奶重。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添食蚯蚓提取液稀釋的桑葉可明顯提高家蠶的體質(zhì)量和存活率。這與覃明和等（1988）前期的研究結(jié)果相一致。本試驗(yàn)同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，添食蚯蚓提取液對家蠶全繭量、繭層量和繭層率等繭質(zhì)指標(biāo)沒有顯著影響，但可以提高蠶絲的品質(zhì)，而覃明和（1989）研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓提取液具有增強(qiáng)體質(zhì)，促進(jìn)絲蛋白積累的作用，其主要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)全繭量、繭層量和繭層率均有提高，同時(shí)繭層氨基酸總量及構(gòu)成繭絲蛋白的主要氨基酸含量均有提高，這可能與家蠶品種、試驗(yàn)環(huán)境及蚯蚓提取液有關(guān)。

丙二醛是膜脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其水平間接反映機(jī)體損傷程度，丙二醛水平升高可使生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，并且通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜構(gòu)型、結(jié)構(gòu)和通透性改變，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激（米智，2013）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添食蚯蚓提取液可降低家蠶血淋巴中丙二醛的含量，這與周億金等（2009）在小鼠血液和肝臟中的研究結(jié)果一致。乳酸脫氫酶是一種細(xì)胞質(zhì)氧化還原酶，可催化乳酸氧化為丙酮酸，是機(jī)體病理損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的標(biāo)志，其水平常常用于細(xì)胞和組織毒理學(xué)領(lǐng)域和臨床生物學(xué)診斷（Akila，2017）。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添食蚯蚓提取液可降低家蠶血淋巴中乳酸脫氫酶的含量，這與徐麒麟等（2019）在成華豬上的研究結(jié)果一致?？偪寡趸芰Ψ从沉藱C(jī)體清除活性氧的能力，蚯蚓提取液對動(dòng)物機(jī)體總抗氧化能力存在差異性。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加蚯蚓提取液可以提高小鼠血清中總抗氧化能力，但蚯蚓提取液對成華豬血清中的總抗氧化能力卻沒有影響。而本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)添食蚯蚓提取液對家蠶血淋巴中總抗氧化能力沒有影響，這一結(jié)果表明蚯蚓提取液對動(dòng)物的總抗氧化能力的影響可能與動(dòng)物種屬有關(guān)。

本研究證實(shí)了添食蚯蚓提取液稀釋處理后的桑葉可促進(jìn)家蠶的生長發(fā)育，間接提高家蠶的抗氧化損傷能力。為蚯蚓提取液在家蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了參考。但是，其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。