何玉華，潘俊林，趙鑫玉，于繼寶，李軒宇

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林左家 132109）

α-卡茄堿是馬鈴薯糖苷生物堿的主要組成成分，占其總量的95%左右。馬鈴薯的副產(chǎn)品未得到很好的開(kāi)發(fā)和利用，馬鈴薯中的糖苷生物堿是影響其利用的主要因素之一。關(guān)于α-卡茄堿毒性方面的報(bào)道較多，但也有研究表明α-卡茄堿具有生物活性，能夠抑制某些炎癥的發(fā)生，對(duì)真菌、霉菌、大腸桿菌、白菜白斑菌和蔥紫斑菌等有很好的抑菌效果，還可以通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡而起到抗癌的作用，對(duì)血管還有保健作用，能夠預(yù)防高血壓的形成（鐘淇濱，2018；郭翔，2014；張磊等，2014）。隨著馬鈴薯渣、莖葉等副產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用，關(guān)于α-卡茄堿的研究也將成為進(jìn)一步的研究熱點(diǎn)，本試驗(yàn)將α-卡茄堿作用于仔豬小腸上皮細(xì)胞，探討其對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況及生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，為其在豬、牛、羊等動(dòng)物飼料中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究（曹軍麗，2018）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 α-卡茄堿（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司），仔豬小腸上皮細(xì)胞系（深圳市豪地華拓生物科技有限公司）。

0.25 %胰酶 （雷布斯，SH30042.01）（王帥偉，2016），4%的多聚甲醛固定液（鄭州佰沃生物質(zhì)材料有限公司，wabcan-062701），聚乙二醇辛基苯基醚（南通豐源化工有限公司）（韓洋洋，2018），抗熒光淬滅封片劑 （Phygene，25 mL），DAPI（Phygene，PH0524）（田青等，2013）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 用α-卡茄堿對(duì)培養(yǎng)的仔豬小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行刺激，α-卡茄堿的添加水平分別為0 μg/mL （A 組）、0.4 μg/mL （B 組）、0.8 μg/mL（C組），每一個(gè)處理分別設(shè) 3個(gè)重復(fù)，在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h的時(shí)候，收取細(xì)胞樣品，然后對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況及生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定 （靳換，2017；何玉華，2017）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)復(fù)蘇后的仔豬小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)（何玉華，2017；趙寶等，2017；郭楠，2015）。

1.4 細(xì)胞增殖率的測(cè)定 本試驗(yàn)采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，在仔豬小腸上皮細(xì)胞中加入α-卡茄堿之后的24、48、72 h采集細(xì)胞樣品，測(cè)定細(xì)胞的MTT值。

在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)候，收集長(zhǎng)勢(shì)不錯(cuò)的仔豬小腸上皮細(xì)胞，然后使用1640培養(yǎng)基，之后對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)整，使其達(dá)到5×104個(gè)/mL，然后接入96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)（何玉華，2017；陳偉，2016；李慧冰，2012；王宇，2005）。 在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 后， 每個(gè)孔中加入 10 μL 的 MTT，在37℃的條件下培養(yǎng)4 h（李好磊，2017）。吸出培養(yǎng)基之后，再加入150 μL的DMSO，進(jìn)行振蕩大約10 min（盧杜丹，2016）。使用酶標(biāo)儀來(lái)測(cè)定各孔的吸光值OD568。

1.5 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

1.5.1 細(xì)胞的傳代 在細(xì)胞密度達(dá)到80%的時(shí)候，將細(xì)胞進(jìn)行傳代：（1）去掉原來(lái)的培養(yǎng)基之后用PBS進(jìn)行清洗；（2）加入1～2 mL 0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞的消化，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，消化1～2 min，便可以看到細(xì)胞變圓、隨即相互分離， 則完成消化 （武躍華，2010）；（3） 參照張君（2017）、盧曉清（2017）的方法進(jìn)行擴(kuò)繁。

1.5.2 細(xì)胞凍存 細(xì)胞凍存步驟為：（1）在長(zhǎng)勢(shì)較好的細(xì)胞中加入1～2 mL 0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察，消化1～2 min，可以看到細(xì)胞變圓、隨即相互分離，則完成消化 （王冠楠，2018；鄭麗萍，2017）；（2）快速棄去胰酶，加入完全培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，1200 r/min，離心 5 min，去上清（錢(qián)保江，2014）；(3）加完細(xì)胞凍存液之后，把凍存管轉(zhuǎn)移到梯度凍存盒里，在-70℃條件下放置過(guò)夜后，把凍存管轉(zhuǎn)到液氮里可以長(zhǎng)時(shí)間的貯存（何玉華，2017）。

1.5.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 細(xì)胞周期檢測(cè)步驟為：（1）在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將長(zhǎng)勢(shì)不錯(cuò)的仔豬小腸上皮細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基調(diào)整，當(dāng)細(xì)胞的密度到1.5×105個(gè)/mL的時(shí)候接入6孔板，每孔中2 mL的細(xì)胞懸液，于 37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜（何玉華，2017）；（2）在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束之后，用0.25%的不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，在消化完成之后收集細(xì)胞，1200 r/min，離心5 min，去掉上清液，PBS重懸并潤(rùn)洗2次 （劉璐，2014）；（3） 逐漸加入預(yù)冷的80%乙醇700 μL，當(dāng)乙醇達(dá)到 70%的濃度時(shí)結(jié)束；（4）4 ℃條件下進(jìn)行固定，要達(dá)到 4 h 以上；（5）1200 r/min，離心5 min， 預(yù)冷PBS潤(rùn)洗2次；（6） 然后加100 μL RNase（50 μg/mL），37 ℃條件下進(jìn)行孵育，時(shí)間為30 min；（7）再加 400 μL 的 PI（50 μg/mL），4 ℃及避光條件下進(jìn)行染色，時(shí)間為30 min；（8）分別于24、48、72 h的時(shí)候用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 α-卡茄堿處理24、48、72 h后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè) （王婷，2015），具體按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-卡茄堿對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞增殖率的影響 從表1可知，α-卡茄堿作用于仔豬小腸上皮細(xì)胞24、48、72 h后，B組、C組細(xì)胞增殖率與A組相比有所降低，且差異顯著（P＜0.05），分別降低3.67%、14.78%，8.63%、20.81%，19.39%、28.18%。

表1 α-卡茄堿對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞增殖率的影響

2.2 α-卡茄堿對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞周期的影響從表 2 可知， G0/G1期，24、48、72 h 時(shí)， 隨著 α-卡茄堿添加水平的增加而逐漸增加，B組、C組和A組相比，分別增加 19.84%、38.30%，19.17%、52.39%，32.17%、56.14%，差異顯著（P＜ 0.05）。S期逐漸降低，B組、C組和A組相比差異顯著 （P＜0.05），24 h 降 低 10.61% 、29.84% ；48 h 降 低14.95%、32.51%；72 h降低 25.13%、40.27%。G2/M期逐漸下降，B組、C組和A組相比24 h時(shí)分別下降 8.66%、12.44%，差異不顯著（P ＞ 0.05）；48 h分別下降 15.73%、69.13%，差異顯著（P ＜ 0.05）；72 h時(shí)分別下降34.40%、86.27%，差異顯著（P＜0.05）。

2.3 α-卡茄堿對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞凋亡的影響從表3可知，細(xì)胞的凋亡率隨著α-卡茄堿濃度和作用時(shí)間的增加而增加。α-卡茄堿作用細(xì)胞24、48、72 h后，B組、C組和A組相比差異顯著（P＜0.05），分別增加220.50%、505.50%，121.93%、218.31%，69.12%、382.54%。

表2 α-卡茄堿對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞周期的影響

表3 α-卡茄堿對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

為了更好地適應(yīng)環(huán)境或者減少外界環(huán)境的干擾，細(xì)胞存在主動(dòng)凋亡的現(xiàn)象，與酶的調(diào)節(jié)、基因的表達(dá)有關(guān)。激素、抗?fàn)I養(yǎng)因子、毒素等都會(huì)抑制細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

中草藥龍葵被很多的研究者發(fā)現(xiàn)并研究，從中提取澳洲茄堿，并作用于肺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其有抑制癌細(xì)胞增殖的作用，主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本試驗(yàn)中α-卡茄堿也抑制了細(xì)胞的增殖，α-卡茄堿作用于仔豬小腸上皮細(xì)胞24、48、72 h 后，0.4、0.8 μg/mL 組細(xì)胞增殖率與 0 μg/mL 組相比有所降低，且差異顯著（P＜0.05）。

陳來(lái)等（2014）通過(guò)多年的試驗(yàn)得出澳洲茄堿對(duì)黑色素瘤B16癌細(xì)胞的抑制作用，通過(guò)多種途徑激活p53通路，這可能是造成黑色素瘤細(xì)胞死亡的根本途徑。龍葵堿可以使HepG2細(xì)胞阻滯在S期，抑制DNA的合成，并誘導(dǎo)其凋亡（任明媛，2017）。龍葵堿對(duì)前列腺癌細(xì)胞系PC-3也具有抑制作用，并誘導(dǎo)其凋亡（章俊等，2011），本試驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果，本試驗(yàn)的結(jié)果表明，G0/G1期，24、48、72 h時(shí)，隨著α-卡茄堿添加水平的增加而逐漸增加，0.4、0.8 μg/mL 組和 0 μg/mL 組相比差異顯著 （P ＜ 0.05）。 S 期逐漸降低，24、、48、72 h時(shí)，0.4、0.8 μg/mL 組和 0 μg/mL 組相比差異顯著（P ＜ 0.05）。G2/M 期逐漸下降，24 h 時(shí) 0.4、0.8 μg/mL組和 0 μg/mL 組相比差不異顯著 （P ＞ 0.05）；48、72 h 時(shí) 0.4、0.8 μg/mL 組和 0 μg/mL 組相比差異顯著（P ＜ 0.05）。

糖苷生物堿（α-卡茄堿和α-茄堿）主要存在于彩色馬鈴薯，其功能很多，有抗癌作用，對(duì)癌細(xì)胞有抑制作用。α-卡茄堿可以使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，破壞細(xì)胞膜的離子通道。α-卡茄堿促進(jìn)細(xì)胞凋亡的途徑有以下幾種：一是促進(jìn)人體肝癌細(xì)胞活性氧自由基的生成而使癌細(xì)胞凋亡；二是通過(guò)提高HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白（ASK1和TBP-2）的表達(dá)，進(jìn)而激活下游信號(hào)激酶如JNK和p38，同時(shí)抑制HepG2細(xì)胞促增殖蛋白HDAC1而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；三是和其他成分的協(xié)同作用。馬鈴薯中的α-卡茄堿對(duì)很多腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，但需要和其他多種活性成分聯(lián)合作用。

4 小結(jié)

α-卡茄堿對(duì)細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用；細(xì)胞的凋亡率隨α-卡茄堿添加水平和作用的時(shí)間的增加而增加；由于α-卡茄堿把細(xì)胞阻滯在G0/G期，因此抑制了細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。