姜淑妍

（長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130504）

大豆異黃酮是從大豆中提取的次生代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)弱雌激素樣作用，具有抗氧化、抗腫瘤等生理功能（徐春華等，2010）。郝振榮等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛的日糧中添加大豆異黃酮能夠增強(qiáng)奶牛的免疫功能，提高奶牛泌乳性能。方洛云等（2015）也研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮能夠提高奶牛體內(nèi)的抗氧化酶活性，改善奶牛的產(chǎn)奶性能。以上結(jié)果說明，大豆異黃酮能夠作為一種添加劑在奶牛上應(yīng)用。乳腺上皮細(xì)胞是合成和分泌乳汁的主要場(chǎng)所，奶牛對(duì)高溫較敏感，當(dāng)環(huán)境溫度過高時(shí)，就會(huì)激活Caspase-3活性，誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞凋亡，從而降低產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)（張響英等，2017）。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加10、100、1000 mg/L大豆異黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和泌乳性能，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力（穆瑩和江連洲，2013；盧志勇等，2013）。目前，研究大豆異黃酮對(duì)高溫下體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響還鮮見報(bào)道。權(quán)素玉等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞在42℃高溫下1.5 h內(nèi)細(xì)胞活率持續(xù)降低，2 h后開始恢復(fù)。說明高溫處理2 h后細(xì)胞逐漸適應(yīng)高溫環(huán)境，存活率短期內(nèi)不再下降。因此，本試驗(yàn)擬在42℃高溫處理1.5 h下，研究大豆異黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮增殖和抗氧化的影響，目的是了解大豆異黃酮能否緩解高溫對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的損傷。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 奶牛選用吉林九臺(tái)廣源牧業(yè)有限公司荷斯坦奶牛；純度為98%的大豆異黃酮購于大連綠峰食品有限公司。奶牛乳腺上皮細(xì)胞采用組織塊法培養(yǎng)。無菌條件下剪取健康荷斯坦奶牛的乳腺組織，清除脂肪，剪成小塊（1 mm3）接種培養(yǎng)，然后參照狄和雙等（2006）方法進(jìn)行細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞活性 將1×104個(gè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種于96孔板中，分為4組，每組基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加 0、10、100 μg/mL 和 1000 μg/mL 大豆異黃酮，每組8個(gè)重復(fù)。大豆異黃酮溶于二甲基亞砜（DMSO），其中DMSO含量為1.5‰。細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，再在42℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1.5 h，然后在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后去除培養(yǎng)液，分別每孔加入培養(yǎng)基100 μL和10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值，然后根據(jù)試劑盒說明書上的公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性。

1.2.2 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 將1×105個(gè)/mL的奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種到12孔板，試驗(yàn)分組同上，每組4個(gè)重復(fù)。細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，再在42℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞，然后使用南京建成試劑盒檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性和一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量。操作步驟和檢測(cè)方法按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.2.3 活性氧（ROS）的檢測(cè) 將 1×105個(gè)/mL的奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種到12孔板，試驗(yàn)分組同上，每組4個(gè)重復(fù)。細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，再在42℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞按照南京建成試劑盒上的方法進(jìn)行處理后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 基因表達(dá)的測(cè)定 將5×105個(gè)/mL的奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種到6孔板，試驗(yàn)分組同上，每組4個(gè)重復(fù)。細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，再在42℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，然后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后去除培養(yǎng)基，根據(jù)Qiagen試劑盒中的說明書進(jìn)行提取RNA，檢測(cè)濃度和純度后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照Takara熒光定量PCR試劑盒說明書上步驟進(jìn)行操作，然后在Bio-Rad PCR儀上進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè)。被檢測(cè)的基因引物根據(jù)Gene Bank中序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由上海生工公司合成。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.3 數(shù)據(jù)分析 先將數(shù)據(jù)用Excle 2010進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，然后用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析 （ANOVA），采用LSD法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性的影響 由表2可知，與0 μg/mL組相比，高溫培養(yǎng)下添加100 μg/mL和1000 μg/mL大豆異黃酮能夠顯著提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性（P＜0.05），其中1000 μg/mL組細(xì)胞活性最高。結(jié)果表明，大豆異黃酮能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。

表2 大豆異黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性的影響

2.2 大豆異黃酮對(duì)細(xì)胞活性氧水平的影響 由表3可知，與0 μg/mL組相比，高溫培養(yǎng)下添加10～1000 μg/mL大豆異黃酮能夠顯著降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性氧的濃度（P＜0.05），且活性氧濃度隨著大豆異黃酮添加水平的升高而顯著下降（P＜0.05）。結(jié)果表明，大豆異黃酮能夠抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生。

表3 大豆異黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性氧水平的影響

2.3 大豆異黃酮對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的影響 由表 4 可知，高溫培養(yǎng)下，100 μg/mL 和 1000 μg/mL大豆異黃酮組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的GSH-Px活性顯著高于 0 μg/mL 和 10 μg/mL 組 （P ＜ 0.05），而NO濃度則相反。細(xì)胞的CAT活性隨著培養(yǎng)基中大豆異黃酮添加水平的升高而顯著升高 （P＜0.05），LDH活性隨大豆異黃酮添加水平的升高而顯著降低 （P＜0.05）。 與0 μg/mL組相比， 添加10～1000 μg/mL大豆異黃酮組細(xì)胞的SOD活性顯著升高（P＜0.05），MDA的濃度顯著降低（P ＜0.05）。結(jié)果表明，大豆異黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力。

表4 大豆異黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化能力的影響

2.4 大豆異黃酮對(duì)細(xì)胞凋亡基因的影響 由表5可知，與0 μg/mL組相比，高溫培養(yǎng)下添加100 μg/mL和1000 μg/mL大豆異黃酮能夠顯著降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)Caspase3和Bax基因的相對(duì)表達(dá)（P＜0.05），但能夠顯著升高細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因的相對(duì)表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)果表明，大豆異黃酮能夠抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。

表5 大豆異黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡基因的影響

3 討論

大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)中形成的一類生物活性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)形式是3-苯并吡喃酮為母核的化合物，屬于黃酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)如大豆黃酮和槲皮素均能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性（陳靜，2012；劉春龍等，2008）。 說明黃酮類物質(zhì)有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。42℃高溫處理下，引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，成活率降低，細(xì)胞凋亡率升高（權(quán)素玉等，2016；周振峰等，2010）。說明熱應(yīng)激能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。有人認(rèn)為，熱應(yīng)激能夠升高心肌細(xì)胞活性氧濃度，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡 （宋學(xué)立等，2000）。機(jī)體在高溫下會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，抗氧化酶類活性下降，促使體內(nèi)活性氧升高，從而造成氧化應(yīng)激（苗啟翔等，2019）。本試驗(yàn)中，在高溫下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的活性氧濃度隨著大豆異黃酮添加水平的提高顯著降低，而細(xì)胞的相對(duì)活性顯著升高；添加100～1000 μg/mL的大豆異黃酮能夠提高細(xì)胞的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性，降低乳酸脫氫酶活性以及一氧化氮和丙二醛含量。結(jié)果說明，大豆異黃酮能夠通過提高細(xì)胞的抗氧化酶類的活性，降低細(xì)胞活性氧濃度，進(jìn)而抑制高溫對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

Caspase家族中的Caspases3是細(xì)胞程序性死亡的介導(dǎo)者和執(zhí)行者，在正常情況下，其以無活性的酶原形式存在于胞漿中，當(dāng)被激活時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞凋亡（趙瑞杰等，2010）。在高溫刺激下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧升高，當(dāng)活性氧積累到一定水平就會(huì)導(dǎo)致Bax表達(dá)和Caspase活化；而Bcl-2能夠影響細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的釋放，抑制自由基的產(chǎn)生以及與Bax結(jié)合來抑制細(xì)胞凋亡 （王彤等，2008）。在本試驗(yàn)中，高溫刺激下，添加100～1000 μg/mL大豆異黃酮能夠降低Caspases-3和Bax的表達(dá)，升高Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果說明，大豆異黃酮能夠緩解高溫促奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的作用。

4 結(jié)論

培養(yǎng)基中添加100～1000 μg/mL大豆異黃酮能夠通過提高細(xì)胞的抗氧化能力，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，下調(diào)Caspases3和Bax的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。