林 潔，李東純，林毓岑，余進(jìn)勝，羅世榮

廣東省惠州市惠東縣人民醫(yī)院檢驗科，廣東惠州 516300

梅毒系蒼白密螺旋體蒼白亞種引起的性傳播性疾病，臨床表現(xiàn)多樣，雖病程發(fā)展相對較慢，但可導(dǎo)致皮膚黏膜、心血管、神經(jīng)、骨骼等多系統(tǒng)病變，不僅損害患者自身身心健康，而且危及下一代健康[1]。相關(guān)流行病學(xué)報道，我國梅毒發(fā)病率自2000年的6.43/10萬增長至2013年的32.86/10萬，年均增長率達(dá)13.37%，已成為重要的公共衛(wèi)生問題[2]。程序性死亡分子1(PD-1)屬CD28超家族成員，主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞表面，PD-1及其配體PD-L1或PD-L2相互作用，如與PD-L1結(jié)合后通過受體分子胞質(zhì)尾部的酪氨酸激酶抑制基序激發(fā)抑制信號，從而介導(dǎo)負(fù)性調(diào)控[3-4]。但當(dāng)前PD-1的臨床研究多側(cè)重于腫瘤疾病，甚至有以PD-1/PD-L1為治療靶點的抗腫瘤藥物，并取得一定治療效果[5]。本研究以本院收治的60例梅毒患者為研究對象，對其外周血PD-1水平及臨床意義進(jìn)行分析，旨在為梅毒的臨床診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018 年6 月至 2019 年 6 月在本院就診的60例梅毒患者為研究對象(梅毒組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS273-2007》梅毒診斷要求；(2)患者知曉研究內(nèi)容并簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并梅毒以外的其他內(nèi)外科疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病；(2)既往使用抗菌藥物、激素或免疫調(diào)節(jié)劑；(3)梅毒病程<2年；治療及隨訪期間有不潔性生活。梅毒患者男33例，女27例；年齡22～61歲，平均(49.24±12.33)歲；<40歲27例，40～60歲20例，>60歲13例；梅毒快速血漿反應(yīng)試驗(RPR)滴度1∶1 13例，1∶2 15例，1∶4 21例，1∶8 11例；臨床分期Ⅰ期19例，Ⅱ期41例。另選取本院同期30例體檢健康志愿者作為對照組，其中男15例，女15例；年齡25～64歲，平均(20.27±12.01)歲。2組研究對象性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 PD-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司；酶標(biāo)分析儀為Rayto RT-2100C型，流式細(xì)胞儀為CYTOMICS FC 500型，均購自美國Beckman Coulter公司；PE鼠抗人PD-1單克隆抗體購自美國BD公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；佛波酯、離子酶素購自美國Sigma公司。

1.2.2外周血PD-1水平檢測 采集研究對象晨間空腹靜脈血標(biāo)本，乙二胺四乙酸抗凝，3 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min分離血漿，ELISA檢測外周血血漿中可溶性PD-1水平。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞比例 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+CD25+hight調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、CD4+CD25+lowTreg、CD4+CD25+lowTreg/CD4+CD25+hightTreg及其細(xì)胞上的PD-1水平。使用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸調(diào)整細(xì)胞水平至(2.0～6.0)×107/mL，RPMI1640培養(yǎng)液1∶1體積稀釋肝素鈉抗凝的全血標(biāo)本，滴加佛波酯、離子酶素充分混勻，終水平分別為10 μg/L、1 mg/L，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，用于PD-1分子檢測。另取刺激后的肝素鈉抗凝全血標(biāo)本50 μL，分別滴加FITC-CD4/APC-CD25+、PE鼠抗人PD-1單克隆抗體，充分混勻后4 ℃下避光孵育30 min，加1.7% NH4Cl溶血劑混勻，室溫靜置5～10 min至溶血完全，1 500 r/min條件下離心5 min，棄上清液，PBS洗滌，300 μL PBS液重懸，F(xiàn)ACSCanto檢測，CYTOMICS FC500型流式細(xì)胞儀及配套分析數(shù)據(jù)，以CD4+T淋巴細(xì)胞設(shè)門讀數(shù)。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較梅毒組、對照組外周血PD-1水平；(2)比較不同性別、年齡、RPR滴度、臨床分期的梅毒患者外周血PD-1水平；(3)分析梅毒患者外周血PD-1與臨床特征的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.12組外周血PD-1水平比較 梅毒組外周血PD-1水平顯著高于對照組[(56.09±8.13)pg/mLvs.(11.20±4.50)pg/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.212,P=0.001)。

2.2不同臨床特征的梅毒患者外周血PD-1水平比較 不同性別、年齡的梅毒患者外周血PD-1水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但RPR滴度為1∶8患者外周血PD-1水平顯著高于1∶1、1∶2、1∶4患者，臨床分期Ⅱ期患者外周血PD-1水平顯著高于Ⅰ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床特征的梅毒患者外周血PD-1水平比較

2.3梅毒患者外周血PD-1與RPR滴度、臨床分期的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血PD-1與RPR滴度、臨床分期呈正相關(guān)(r=0.659、0.433，P<0.01)。見圖1。

注：A表示外周血PD-1與臨床分期的相關(guān)性分析，B表示外周血PD-1與RPR滴度的相關(guān)性分析。

2.42組外周血CD4+CD25+hightTreg、CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞比較 2組CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但梅毒組外周血CD4+CD25+hightTreg細(xì)胞顯著高于對照組，CD4+CD25+lowTreg/CD4+CD25+hightTreg顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組外周血CD4+CD25+hightTreg、CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞比較

2.52組外周血PD-1+/CD4+CD25+hightTreg、PD-1+/CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞上的表達(dá) 梅毒組外周血PD-1+/CD4+CD25+hightTreg、PD-1+/CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞上的表達(dá)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組外周血PD-1+/CD4+CD25+hightTreg、PD-1+/CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞上的表達(dá)

3 討 論

研究指出，PD-1及其配體PD-L1信號通路在幫助機(jī)體形成自身免疫耐受的同時，也被慢性感染病毒利用，通過這一通路削弱機(jī)體抗感染免疫，促進(jìn)病毒的持續(xù)感染[6]。肖健等[7]報道，HIV感染患者CD8+T細(xì)胞PD-1存在過表達(dá)現(xiàn)象，不僅與病毒載量呈正相關(guān)，且體內(nèi)阻斷PD-1/PD-L1通路或可發(fā)揮CD8+T細(xì)胞功能，認(rèn)為基于該信號通路或可為臨床治療HIV感染提供理論指導(dǎo)。梅毒同為慢性病毒感染性疾病，但筆者查閱文獻(xiàn)未見PD-1在梅毒患者中的表達(dá)的報道。本研究結(jié)果顯示，梅毒組外周血PD-1水平顯著高于對照組，且雖不同性別、年齡的梅毒患者外周血PD-1水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但RPR滴度為1∶8患者外周血PD-1水平顯著高于1∶1、1∶2、1∶4患者，臨床分期Ⅱ期患者外周血PD-1水平顯著高于Ⅰ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血PD-1與RPR滴度、臨床分期呈正相關(guān)。

既往研究報道，在病毒性感染疾病中，持續(xù)的病毒刺激可導(dǎo)致免疫損傷[8-9]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞不僅可糾正持續(xù)病毒復(fù)制引起的免疫系統(tǒng)過度激活，也能抑制抵抗病毒復(fù)制的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮“雙刃劍”的作用[10-11]。其中CD4+CD25+hightTreg作為高表達(dá)的CD4+Treg主要發(fā)揮抑制活性，可抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖活化，其數(shù)量或功能的缺失與自身免疫性疾病的免疫平衡紊亂、疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。在慢性病毒感染性疾病中，為進(jìn)一步明確梅毒患者外周血PD-1的表達(dá)，本研究分析梅毒患者外周血CD4+CD25+hightTreg、CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞及細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，梅毒組與對照組CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但梅毒組外周血CD4+CD25+hightTreg細(xì)胞顯著高于對照組，CD4+CD25+lowTreg/CD4+CD25+hightTreg顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),這與張明海等[14]的報道結(jié)論相似。且梅毒患者外周血PD-1+/CD4+CD25+hightTreg、PD-1+/CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞上的表達(dá)顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可見，梅毒患者不僅外周血PD-1水平存在高表達(dá)現(xiàn)象，外周血CD4+CD25+hightTreg、CD4+CD25+lowTreg細(xì)胞及細(xì)胞表面PD-1也存在過度表達(dá)現(xiàn)象。

本研究也存在一定的局限性，除標(biāo)本數(shù)量相對較少外，受標(biāo)本采集時間影響，本研究未能進(jìn)一步分析梅毒血漿固定患者外周血PD-1、CD4+CD25+Treg細(xì)胞及細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)情況。另外，梅毒感染引起PD-1表達(dá)上調(diào)的確切機(jī)制、PD-1對CD4+CD25+Treg細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)制等，或兩者間的相互協(xié)調(diào)機(jī)制等仍未明確，筆者擬在下階段工作中持續(xù)深入探究。

綜上所述，梅毒患者不僅外周血PD-1存在過表達(dá)現(xiàn)象，與RPR滴度、臨床分期呈正相關(guān)，且CD4+CD25+Treg細(xì)胞及細(xì)胞表面PD-1也存在過表達(dá)現(xiàn)象，但基于本研究局限性，其具體機(jī)制仍有待持續(xù)探究。