陳曉星,翟 廣,戈佳云,魏 東,施智甜,郭志唐,王 滔,趙松凌,王連敏,王 琳
(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽外科,云南昆明 650101)
原發(fā)性肝癌(Primary carcinoma of the liver),簡稱肝癌,是原發(fā)于肝臟的上皮性惡性腫瘤,其中超過90%的肝癌為肝細胞癌,每年約有70 萬新患者被確診[1-2]。原發(fā)性肝癌目前是我國第4 位常見惡性腫瘤,肝細胞癌嚴重危害我國人民的身體健康,也給社會及人們帶來巨大的損失[3-4]。就目前,肝癌的治療主要包括根治性治療和姑息治療。根治性治療包括肝臟移植、手術(shù)切除和局部消融治療;姑息性治療如藥物治療、放療、化療等。但許多肝癌患者在發(fā)現(xiàn)時即為中晚期,能接受的治療方式十分有限[5-7]。因此,闡明肝癌的發(fā)病機制、尋找敏感和特異的肝癌早期分子診斷標志物,將有利于肝癌的早期診斷和及時治療,對提高患者治愈率和生存率具有重要意義。
人類Dachshund1(DACH1)基因是果蠅Dac基因的同源基因,位于染色體13q22,其編碼的蛋白質(zhì)主要分布于細胞核內(nèi)。可以通過與c-Jun、Smads、Six 和ER 等轉(zhuǎn)錄因子相互作用,在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面發(fā)揮重要功能[8-9]。DACH1 作為正常生理過程中血管重塑及上皮細胞遷移等作用的重要調(diào)控因子[10],在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌,乳腺癌,前列腺癌、等多種腫瘤中作為腫瘤抑制因子,且有許多證據(jù)顯示其可作為多種腫瘤預(yù)后的標志物[11-12]。本研究進一步探討DACH1 在肝癌中的生物學作用及其作用機制,以期為肝癌的早期診斷、治療和預(yù)后評估提供幫助。
正常肝細胞株LO2;以及三株肝癌細胞系(HepG2、Hep3B、Huh7)由中國科學院昆明動物研究所提供。
成年雄性BALB/C-nu/nu 小鼠,體重(18±2)g,由昆明醫(yī)科大學實驗動物學部提供。
樣本來源于2019 年5 月至2020 年2 月昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽外科行根治性肝癌切除術(shù)的HCC 患者30 例,納入標準:臨床資料完整;術(shù)前均無其他治療,如TACE、免疫治療等,患者已簽訂知情同意書,并且該實驗臨床樣本通過了昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理學審查。
碧云天生物技術(shù)有限公司的檢測蛋白濃度BCA 試劑盒(上海);索萊寶科技有限公司的HE(蘇木素-伊紅)試劑染色盒(北京);DACH1 抗體、CyclinD1 抗體、CDK4 抗體、CyclinE1 抗體、CDK2 抗體購自Abcam 公司;SP 免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋科技公司);DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和Lipofectamine2000TM購自Thermo Fisher Scientific 公司;CCK8 試劑盒購自日本同仁公司,PI 染色試劑盒購自BD 公司,DACH1 慢病毒表達載體購自復(fù)能公司。
石蠟切片由4 ℃取出復(fù)溫2 h,再烤片60℃1 h。二甲苯中脫蠟,依次放入100%、95%、85%、75%乙醇和ddH2O 中水化。然后,放入3%的甲醇過氧化氫液中,室溫靜置20 min。高壓修復(fù),冷卻至室溫。覆蓋50 μL 封閉液(1%BSA),37 ℃封閉30 min 后,去除封閉液,覆蓋DACH1 一抗(1:200)4℃過夜。第2 天取出后,室溫復(fù)溫15 min,加SP 免疫組化試劑盒中二抗,37℃孵箱孵育30 min,滴加現(xiàn)配的DAB 顯色液,蘇木素染液復(fù)染梯度酒精脫水、二甲苯(15 min),取出切片晾干后,用中性樹脂封片,免疫組化每張切片選取中心和4個周邊共計5 個高倍視野觀察,用Image-pro Plus 6.0 軟件計算陽性比率。
所有的肝癌細胞系和用于包裝的293T 細胞都是來自中國科學院昆明動物研究所。所有細胞在DMEM 培養(yǎng)基中補充10%的胎牛血清中,細胞在37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine2000TM。
使用的DACH1 慢病毒表達載體采用復(fù)能公司病毒包裝系統(tǒng)通過293T 細胞包裝DACH1 過表達和對照慢病毒。采用慢病毒液和培養(yǎng)基1:1 比例感染肝癌細胞,在感染72 h 后收集細胞并進行Western blotting 以評估DACH1 蛋白的表達。
通過Western blotting 檢測肝癌細胞系:LO2、HepG2、Hep3B、Huh7。簡要地說,使用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白,然后,蛋白質(zhì)用BCA 蛋白測定試劑盒定量。然后,樣本通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。β-肌動蛋白為內(nèi)參對照,用5%的無脂牛奶封閉,一抗體分別孵育:小鼠抗DACH1 抗體(1:1000),小鼠抗β-Actin 抗體(1:5 000)。然后將膜與二抗一起孵育(山羊抗小鼠IgG)。后進行顯影,曝光。蛋白條帶使用Image J 軟件進行灰度分析并計算相對蛋白表達。
使用CCK8 估算存活細胞的數(shù)量。感染后24 h,HepG2 細胞接種在96 孔板中。含有10%FBS的培養(yǎng)基,密度為2 000 個細胞/孔。為了定量細胞活力,將培養(yǎng)物染色在24、48、72、96 h 后每孔添加10 μL CCK8 溶液在37℃下孵育2 h,之后吸光度是在450 nm 下使用酶標儀檢測OD 值。
感染48 h 后,兩者胰蛋白酶消化后收集漂浮細胞和貼壁細胞用冰冷的PBS 洗滌;然后在-20℃使用70%的PBS 乙醇將細胞固定過夜。固定細胞然后用20 μg/mL RNaseA 和50 μg/mL 處理碘化丙錠在室溫下放置30 min;然后將染色的細胞立即染色使用Accuri C6 流式細胞儀。使用隨附的軟件分析數(shù)據(jù),以及平均值和標準偏差-進行計算。每個樣本1 0000個細胞,并將實驗重復(fù)三遍。
感染48 h 后進行周期相關(guān)蛋白檢測,一抗體分別孵育:小鼠抗CyclinD1 抗體(1:2 000);小鼠抗CDK4 抗體(1:1 000);小鼠抗CyclinE1 抗體(1:1 000);小鼠抗CDK2 抗體(1:500)。
BALB/C-nu/nu 小鼠8 只裸鼠隨機分為兩組:a慢病毒對照HepG2 細胞組;b 表達DACH1 慢病毒HepG2 細胞組。將感染的HepG2 細胞(2×106)重懸100 μL 的無血清DMEM 中,相同體積的基質(zhì)膠混合后皮下注射接種到BALB/ C 裸鼠一個點。接種第10 天腫瘤形成按照第0 天開始測量腫瘤大小,按照第3、6、9 天測量腫瘤大小,腫瘤的長徑(a)和短徑(b)進行測量,然后使用公式V=1/2a×b2。第9 天對動物實施安樂死,并取出腫瘤,稱重并進行免疫組織化學觀察DACH1 表達情況。
免疫組化染色后,DACH1 陽性呈棕黃色,且定位于細胞核,HCC 癌組織中DACH1 的表達低于癌旁組織(圖1)。Normal 組與術(shù)HCC 癌組織相比有統(tǒng)計學差異(61.87 ± 1.771)vs (28.79 ±2.079),P<0.05。
圖1 HCC 患者癌組織和正常組織中DACH1 的表達(×200)Fig.1 Expressions of DACH1 in cancer and normal tissues of HCC patients (×200)
研究DACH1 在肝癌細胞中的表達水平,正常肝細胞株LO2;以及三株肝癌細胞系(HepG2、Hep3B、Huh7)分析。結(jié)果顯示所有細胞系均表達DACH1,正常細胞水平高于肝癌細胞水平。另外,我們的結(jié)果表明在HepG2 細胞系中DACH1 的表達明顯低于其他細胞系,見圖2。
圖2 通過蛋白質(zhì)印跡檢測DACH1 蛋白水平Fig.2 DACH1 protein levels detected by Western blotting
蛋白質(zhì)印跡分析檢測表達DACH1 慢病毒感染和對照病毒感染的HepG2 細胞中DACH1 蛋白表達情況,根據(jù)結(jié)果,DACH1 顯著在DACH1 慢病毒感染中過表達(圖3A)。
使用CCK8 法測定DACH1 慢病毒感染和對照病毒感染的HepG2 細胞的增殖。分別在24、48、48,96 h 測定OD 值,結(jié)果顯示DACH1 慢病毒感染細胞增殖明顯低于對照病毒感染細胞,表明高表達DACH1 的細胞生長是明顯被抑制(圖3B)。
慢病毒感染后48 h 后通過流式細胞術(shù)檢測HepG2 細胞周期分布。結(jié)果顯示被DACH1 上調(diào)細胞表現(xiàn)出G0/G1 期細胞較多,而S 期細胞較少與對照感染的細胞相比(52.80±3.18)vs(67.82±2.41),P< 0.01;(32.77±1.94)vs(22.91±1.90),P< 0.01。G2/M 期兩者之間沒有明顯區(qū)別(圖4)。
慢病毒感染后48 h 后通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測HepG2 細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4、CyclinE1、CDK2。結(jié)果顯示被DACH1 上調(diào)細胞表現(xiàn)出周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4、CyclinE1、CDK2 表達都下調(diào),與對照慢病毒感染的細胞比較[(0.78±0.04)vs (0.42±0.06),P< 0.01];[(0.56±0.03)vs (0.36±0.05),P< 0.05];[(0.64 ±0.03)vs(0.27 ±0.02),P< 0.01];[(0.71±0.07)vs(0.47±0.06),P<0.05],見圖5。
檢測DACH1 在腫瘤生長作用,用表達DACH1,對照的慢病毒,并接種到BALB/C 裸鼠的皮下。由DACH1 感染的細胞導(dǎo)致的腫瘤重量大約減輕了三倍與對照感染細胞比。通過腫瘤形成后0、3、6、9 d 測量腫瘤體積可見DACH1 感染的細胞腫瘤生長速度明顯減慢(圖6A)。免疫組化染色后,DACH1 陽性呈棕黃色,且定位于細胞核(圖6B),DACH1 感染的細胞接種的腫瘤中DACH1 的表達高于對照感染細胞接種的腫瘤有統(tǒng)計學差異[(5.89±0.23)vs(16.77±0.79),P<0.01]。
圖3 DACH1 過表達時細胞增殖情況Fig.3 Cell proliferation during overexpression of DACH1
圖4 流式細胞術(shù)檢測HepG2 細胞周期
圖5 DACH1 過表達時周期相關(guān)蛋白的變化情況Fig.5 Changes of periodic related proteins during overexpression of DACH1
圖6 DACH1 調(diào)節(jié)肝癌的發(fā)生(×200)Fig.6 DACH1 regulated the tumorigenesis of HCC cancer (×200)
近年來多項研究表明DACH1 基因在多種癌細胞中呈現(xiàn)低表達,在多種腫瘤中發(fā)揮了抑癌基因的作用,DACH1 基因抑制細胞增殖和遷移在乳腺癌細胞中得到證實[13-15],在肺腺癌中,DACH1 可以抑制非小細胞肺癌的克隆形成和細胞增殖[16],在前列腺癌中,DACH1 可以抑制前列腺癌細胞的DNA合成、增殖、克隆形成[15]。在肝癌中,本研究進一步證實DACH1 可能具有抑癌作用。筆者對DACH1 在肝癌中的生物學功能進行了研究,筆者發(fā)現(xiàn)DACH1 可以抑制肝癌細胞系HepG2 的增殖和裸鼠體內(nèi)成瘤,表明DACH1 在體外和體內(nèi)都可以抑制肝癌的生長。為了進一步探索DACH1 抑制肝癌細胞增殖的原因,筆者檢測了DACH1 對HepG2細胞周期的影響。結(jié)果表明,DACH1 可以使肝癌細胞系HepG2 的G0/G1 期細胞增多、S 期細胞減少??梢?,DACH1 抑制肝癌細胞增殖主要是通過調(diào)控細胞周期來實現(xiàn)的。
細胞周期是一個非常復(fù)雜的過程,涉及到大量調(diào)節(jié)蛋白,細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK2 和CDK4)和細胞周期蛋白(cyclinD1 和cyclinE1)是調(diào)控細胞周期的兩大家族,CDK4 和cyclin D1 在G0/G1 期表達升高,促進細胞從G0/G1 期向S 期轉(zhuǎn)變[16-19],在這些蛋白的作用下,細胞按順序經(jīng)過DNA 合成前期(G1)、DNA 合成期(S)、有絲分裂前期(G2)和有絲分裂期(M)。為了進一步證實DACH1 肝癌細胞增殖主要是通過調(diào)控細胞周期來實現(xiàn),研究中對依賴性蛋白激酶(CDK2 和CDK4)和細胞周期蛋白(CyclinD1 和CyclinE1)的表達水平進行了檢測。結(jié)果顯示,DACH1 可以降低這些依賴性蛋白激酶和細胞周期蛋白的表達水平。從而證實,DACH1 可以誘導(dǎo)肝癌細胞系HepG2 細胞周期G1/S 阻滯。
綜合以上研究結(jié)果,DACH1 可以抑制肝癌細胞系HepG2 細胞增殖和裸鼠體內(nèi)成瘤,在肝癌中發(fā)揮了抑癌基因的作用。DACH1 主要是通過誘導(dǎo)細胞周期G1/S 阻滯,使G1 期細胞增多、S 期細胞減少,從而抑制肝癌細胞的增殖。