李 林，左青青，謝 欣，劉朝波，陳 立，張 俊，錢 剛

(1.遵義醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院細胞生物學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 第一臨床學院，貴州 遵義 563099)

千里光(SenecioscandensBuch.-Ham.Ex D.)，為菊科(Composite)千里光屬多年生草本植物，其性寒、味苦，具有清熱解毒、明目、止癢等功效，多用于風熱感冒、目赤腫痛、泄瀉痢疾、皮膚濕疹瘡癤[1-2]等治療，是我國應用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥?，F(xiàn)代藥理學研究表明，千里光中主要含有生物堿類、酚酸類、黃酮類、萜類等多種成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化及清除自由基和毒理等作用[3]，也是千里光抗菌作用的有效成分[4]。而從代謝合成上看，植物酚酸類、黃酮類化合物的苯丙基骨架主要通過苯丙烷代謝途徑合成[5]，結(jié)構(gòu)上看生物堿類、菲類、聯(lián)菲類等化合物均是具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物，其對應苯丙基單元主要由苯丙烷代謝通路提供。因此，作為苯丙烷途徑的限速酶的苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)，也被認為是上述化合物合成途徑中的重要酶，是藥用植物化學成分合成以及調(diào)控研究中的重要內(nèi)容。此外，PAL也參與植物的生長發(fā)育等生物學過程，對抵御病蟲害、防紫外線及構(gòu)成植物支撐系統(tǒng)等具有重要作用[6]。目前國內(nèi)外對PAL的研究報道較多，但主要集中在它的提取純化、抗逆境、生理作用等方面[7]，關于千里光苯丙氨酸解氨酶的研究還未見報道。

本研究中對具有良好抗菌性的千里光材料中的苯丙氨酸解氨酶基因進行克隆，對其編碼蛋白進行分子特征及系統(tǒng)生物學進化分析，為分析高等植物PAL的基因結(jié)構(gòu)研究提供基礎資料，對揭示千里光藥用成分合成乃至抗菌性狀機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑 試驗材料：本課題組采自貴州省遵義地區(qū)的野生千里光，并經(jīng)抗菌性實驗(MIC，最低抑菌濃度)證實具有良好抗菌性，且材料間抗菌水平顯著差異(SC32>SC35)儀器：冷凍離心機(Thermo MICRO 21/21R型)，凝膠成像儀(BIO-RAD Gel DocTM XR+型)，水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司DYCP-31DN型)，紫外分光光譜儀(Eppendorf AG 22331Hamburg型)。試劑：總RNA提取試劑盒(RNeasy Plant Mini Kit)購自天根公司；cDNA第一鏈合成試劑盒(SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit)購自寶生物公司；其它常規(guī)試劑購自擎科生物技術公司。

1.2pal基因克隆 以NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的黑心菊(Rudbeckiahirta)pal核酸序列(gi:EF070337.2)與千里光轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(SC35:SAMN10688662,SC32:SAMN10688663)進行比對，將其中得分最高的序列(Transcripts)挑出作為千里光pal候選序列，運用NCBI的BLAST在線分析軟件進行候選千里光pal核苷酸序列比對分析，并利用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析核苷酸序列的開放閱讀框，并以此序列設計全長引物。

采用 TRIzol 法分別提取SC32和SC35千里光葉片總RNA，DNase I處理去除其中殘留基因組DNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成第1鏈cDNA(Transgene,Cat:AT301-02)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，Themo公司Taq酶(Cat:F534S)，基因特異引物(SCPAL1F:5'-ACCGACCCATATTCACATT,ScPAL1R:5'-CTCATTCACTCATTCC-TTCCTA)進行全長擴增。PCR程序，95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)，72 ℃10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標條帶(天根，Cat:DP209-03)，連接轉(zhuǎn)化(擎科，TSV-007BS)，挑取克隆、送樣測序(上海生工)。

1.3 序列的生物信息學分析 對獲得的具有ORF閱讀框的全長核酸序列采用Expasy Prot Param(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析千里光苯丙氨酸解氨酶的分子量、等電點和氨基酸組成；用NetPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對千里光苯丙氨酸解氨酶磷酸化位點的預測；用ignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對預測蛋白信號肽進行分析；CD-Searchhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，MEME(http://meme-suite.org/)分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；MEGA6.0進行多物種pal基因系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 千里光苯丙氨酸解氨酶基因克隆 以黑心菊(Rudbeckiahirta)pal基因核酸序列(gi:EF070337.2)搜索千里光轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，挑選出1個高度相似的full length reads作為千里光苯丙氨酸解氨酶的候選序列。以此核酸序列設計包含整個ORF閱讀框的特異引物(ScPAL1F/R)，以SC32與SC35的cDNA為模板，擴增分別獲得長度約為2 100 bp片段(見圖1)。經(jīng)回收、克隆測序檢測，結(jié)果顯示SC32與SC35中該序列全長均為2 159 bp，與轉(zhuǎn)錄組拼裝的核酸序列一致。ORF finder查找開放閱讀框發(fā)現(xiàn)，該序列包含一個完整的開放閱讀框，全長2 124 bp，編碼708個氨基酸殘基。以該序列作為候選千里光pal基因，進行后續(xù)生物信息學分析。

M:Trans 2K DNA maker；1:SC32；2：SC35。

2.2 PAL蛋白序列特征分析 為明確候選千里光pal基因是否屬于苯丙氨酸解氨酶家族成員，將其在理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)上與擬南芥、煙草、秈稻等模式植物、近緣植物的PAL家族成員進行了比較。分析來源不同的PAL蛋白進行理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，各物種的氨基酸序列包含殘基數(shù)為707～723，分子量77.76 ～78.52 kDa，表明各苯丙氨酸解氨酶基因在序列長度與分子量上無太大差異；而其等電點與潛在磷酸化位點分析發(fā)現(xiàn)15個不同物種PAL的氨基酸等電點范圍為5.41～8.14，潛在磷酸化位點為53～66個，表明其氨基酸組成與結(jié)構(gòu)有較大差異(見表1)。采用SignalP對信號肽進行預測，所選用的不同物種的PAL均無信號肽，表明PAL是非跨膜蛋白，可能分布于細胞質(zhì)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，本實驗所得千里光PAL蛋白也符合此特點。

表1 不同物種的PAL蛋白的序列特征

以黑心菊、雪蓮、紫莖澤蘭與千里光進行苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列比對，結(jié)果表明4個物種的氨基酸序列高度相似(92.22%)，其中內(nèi)部序列上相似度高，但N端存在較大差異，是序列間長度差異形成的主要區(qū)域。同時，InterPro在線分析發(fā)現(xiàn)，千里光苯丙氨酸解氨酶具有保守結(jié)構(gòu)域phe_am_lyase(TIGR01226，氨基酸位點：16-697)，屬于Lyase class I_like 超基因家族成員，其活性位點(GTITASGDLVPLSYIAG，189～206)與黑心菊和雪蓮相同，僅與紫莖澤蘭有1個位點差異(見圖2)。

黑心菊(gi:EF070337.2)，雪蓮(gi:KR811215.1)，紫莖澤蘭(gi:GQ259805.1)；黑色背景表示同源性為100%，紫色背景表示同源性為75%，藍色背景表示同源性為50%，“·”表示氨基酸缺失。

2.3 PAL系統(tǒng)進化構(gòu)建與保守結(jié)構(gòu)域分析 從NCBI中下載包括擬南芥、煙草、水稻等模式植物與近緣物種PAL氨基酸序列(E-value =0.0)，采用鄰接法(NJ)建系統(tǒng)進化樹，比較分析15個物種中該基因的進化與親緣關系，結(jié)果顯示千里光(SsPAL)與青蒿(PWA39244.1)、雪蓮(KR811215.1)的苯丙氨酸解氨酶歸于一個亞支，表明在進化上具有較近的親緣關系，與秈稻(CAA61198.1)、擬南芥(AAP59440.1)分支距離最大，進化上親緣關系較遠(見圖3A)。在線查找序列保守結(jié)構(gòu)域表明，全部序列均具有6個保守結(jié)構(gòu)域順序排列，在第2、3個motif 間的序列要長于其它相鄰兩個結(jié)構(gòu)域(見圖3B、C)，表明pal基因在進化上較為保守。

青蒿(gi:PWA39244.1)，向日葵(gi:XP_022000808.1),雪蓮(gi:KR811215.1),白菊花(gi:AGU91428.1),煙草(gi:XP_009625397.1),辣椒(gi:PHU06526.1),長春花(gi:BAA95629.1),毛白楊(gi:KP770017.1),甘藍型油菜(gi:XM_009117772.3),前胡(gi:AYJ76815),紫莖澤蘭(gi:GQ259805.1),秈稻(gi:CAA61198.1),擬南芥(gi:AAP59440.1),黑心菊(gi:EF070337.2),千里光S.sPAL。

3 討論

苯丙氨酸解氨酶是植物由初生代謝轉(zhuǎn)入次生代謝的重要酶類，也被證明參與植物的生長、抗病、次生代謝等重要的生命活動中。近年來，在中藥材中關于苯丙氨酸解氨酶基因的研究也很多，石斛[8]、白及[9]、丹參[10]等重要中藥材中的pal基因的結(jié)構(gòu)信息得到了解析。本文首次對千里光的pal基因的序列進行生物信息學分析，為千里光的抗菌性為代表的藥用性狀的研究提供基礎資料。

本研究通過篩選千里光轉(zhuǎn)錄組測序并通過基因特異引物進行擴增驗證，獲得全長為2 159 bp，編碼708個氨基酸的苯丙氨酸解氨酶蛋白質(zhì)。通過與近緣物種黑心菊、紫莖澤蘭的苯丙氨酸解氨酶基因比對發(fā)現(xiàn)高度的相似性，進一步通過生物信息學分析千里光PAL的磷酸化位點、親疏水性、信號肽等信息，表明與其它植物的PAL氨基酸序列在保守結(jié)構(gòu)域、活性位點上表現(xiàn)出一致性。千里光PAL無信號肽，與石斛[8]相同，屬于非分泌蛋白。包括千里光在內(nèi)的15種植物PAL氨基酸序列的進化分析表明，千里光PAL在進化上與青蒿、雪蓮具有更近的親緣關系。

植物酚酸[10]、、類黃酮[11]、生物堿[12]等次生代謝產(chǎn)物均是千里光的抗菌藥用成分，其合成積累與植物苯丙烷代謝途徑及關鍵酶具有密切的關系，作為該途徑關鍵酶的苯丙氨酸解氨酶可能在千里光的抗菌性狀形成與組成上均具有重要的意義。因此，對該酶的基因進行克隆，并進行序列與系統(tǒng)進化分析對于進一步解析千里光類黃酮與酚酸類化合物為代表的抗菌性狀產(chǎn)生機制研究具有積極作用。