高 麗，許 偉，李 萍，楊 琨，宋 琦

(1.遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 牙周科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099)

牙周病原微生物可通過多種途徑影響血管內皮細胞(Vascular endothelial cell,VEC)的功能，在牙周病與心血管疾病的相關性研究中占有核心地位。牙齦卟啉單胞菌(Porphyrom onas gingivalis,P.g)是紅色復合體的重要成員之一，被認為是證據(jù)充分的高致病性牙周病原菌，在動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用[1]。

P.g可產(chǎn)生大量破壞宿主組織的毒力因子，對細菌的毒性起到了決定性作用，其中LPS是P.g眾多毒力因子中最為重要的一種因子[2]。

P.g可以侵入各種類型的內皮細胞，包括HUVEC、人主動脈內皮細胞(Human aortic endothelial cells,HAEC)、心臟內皮細胞[3]，導致細胞粘附分子表達的增加，并通過誘發(fā)宿主免疫反應促進炎癥介質(IL-6、MCP-1)的產(chǎn)生[4]，從而引起內皮細胞損傷及功能障礙，這可能是牙周炎與心血管疾病相關聯(lián)系的機制之一。由于內皮細胞是動脈粥樣硬化過程中受影響的主要細胞之一，因此它們已廣泛用作體外模型系統(tǒng)，以鑒定牙齦卟啉單胞菌的潛在毒力機制。近年來，由于TP對癌癥和其它多種疾病(糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等)具有多重保護作用而成為研究的重點[5]。TP與牙周疾病的相關研究認為，TP具有一定的抗菌特性，其可抑制中間普氏菌、P.g、伴放線放線桿菌及具核梭桿菌等多種牙周重要致病菌的生長[6]。

本研究通過不同濃度的TP干預牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Pg-LPS)誘導的HUVEC炎癥反應模型，討論TP對Pg-LPS誘導的VEC中MCP-1、IL-6表達水平的影響，初步分析TP對VEC的調節(jié)和保護作用，以期為牙周病及心血管疾病的防治，開發(fā)新型抗心血管疾病藥物提供新的思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 TP(純度≥98%)，中國陸圣康源公司；Pg-LPS(美國InvivoGen公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；單道可調式移液器(德國Eppendorf公司)；全波段酶標檢測儀(1500，美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(TMS-1015，日本OLYMPUS公司)；電泳儀(美國BIO-RAD公司)；凝膠圖像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；熒光倒置顯微鏡(DP50，日本OLYMPUS公司)；IL-6、MCP-1酶聯(lián)免疫試劑盒(伊萊瑞特生物有限公司)；IL-6、MCP-1單克隆抗體(Cell Signaling Technoiogy，英國)；兔抗人VIII因子抗體(博士德，中國)，蛋白marker(Thermo，立陶宛)。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)及鑒定 本研究獲遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，收集產(chǎn)科健康產(chǎn)婦正常足月剖宮產(chǎn)臍帶組織(產(chǎn)婦均知情同意)。嚴格按照無菌操作技術，取長度約0.2 m的新生兒臍帶，放入預冷至4℃的無菌凍存管中(含雙抗的PBS buffer)，迅速轉移至實驗室，進行HUVEC的分離培養(yǎng)；無菌盒內，用無菌PBS反復沖洗靜脈至流出液清亮無色為止，分離臍靜脈，酶消化法收集細胞，于37 ℃、5%CO2、飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，待細胞鋪滿瓶底80%～90%后，加入37 ℃預熱的0.25%胰蛋白酶1 mL，37 ℃、5% CO2、100%濕度培養(yǎng)箱中消化1～2 min，按1∶2進行傳代。取3～4代對數(shù)生長期細胞用于實驗。采用DAB法進行Ⅷ因子相關抗原免疫組化鑒定細胞來源。

1.2.2 HUVEC的分組與處理 選擇生長狀態(tài)良好的第四代HUVEC，用1mL濃度為0.25%的胰蛋白酶(Trypsin)消化20 min，制成2×105/mL濃度的細胞懸液，接種于6孔板中，每孔2 mL，置于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至鋪滿板底80%時，PBS洗3次，每次1 min，吸盡殘留PBS；按陰性對照組(Control)、陽性對照組(LPS)、LPS+TP1組、LPS+TP2組分組，每組設3個復孔；LPS+TP1組加入5 mg/LTP培養(yǎng)液，LPS+TP2組加入40 mg/LTP培養(yǎng)液，其余組更換原培養(yǎng)液，放入37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育12 h后，去除培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗3遍，Control組更換原培養(yǎng)液，另外3組加入Pg-LPS培養(yǎng)液(10 mg/mL)，孵育1d，建立實驗模型。

1.2.3 TP對Pg-LPS誘導的HUVEC中炎癥因子表達水平的影響

1.2.3.1 ELISA法檢測L-6和MCP-1蛋白含量 ①將低溫保存的各組細胞培養(yǎng)上清液(-80 ℃冰箱)及ELISA檢測試劑盒(4 ℃冰箱)取出，靜置0.5 h，平衡至室溫。②建立標準孔:將標準品加入0.5 mL蒸餾水混均，配制成2 000 pg/mL 的溶液，采用倍比稀釋法，使最終獲得MCP-1的濃度分別為240、160、80、40、20 ng/L，IL-6的濃度分別為6、4、2、1、0.5 ng/L。③蛋白測定:每孔加入待測樣品10 μL，將反應板充分混均，封板，37 ℃ 孵育120 min，洗板；加入100 μL 第一抗體工作液，混均，37 ℃孵育30 min，洗滌。加入50 μL 稀釋好的酶標抗體，混均，37 ℃ 孵育30 min，洗滌。加入50 μL 新鮮配制的底物工作液；加入50 μL 反應終止液，混均。15 min之內用酶標儀在450 nm 波長處讀取各孔光密度值(Optical density,OD)。

1.2.3.2 Western blot法檢測IL-6 和MCP-1的蛋白表達水平 按1.2.2實驗組分組，各實驗組用細胞刮收集細胞，加入100 μL漿蛋白抽提試劑(PMSF終濃度為1 mM)，轉移至預冷的的離心管，渦旋混勻，冰浴15 min，12 000 g、4 ℃離心10 min，提取漿蛋白保存?zhèn)溆茫粚?0～100 μL核蛋白抽提試劑(PMSF終濃度為1 mM)加入沉淀，渦旋混勻，冰浴15 min，12 000 g、4 ℃離心10 min，吸取核蛋白保存?zhèn)溆?；所有蛋白樣品分別經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，分別加入羊抗兔IL-6 和MCP-1單克隆抗體，比例分別為1∶1 000和1∶800，4 ℃搖床孵育過夜；于搖床上先用TBST洗膜2次，每次10 min，滴加羊抗兔IgG二抗，比例為1∶20 000，37 ℃搖床孵育60 min；TBST洗膜，ECL試劑盒顯影，晾干膠片，圖片掃描，保存；運用AlphaEaseFC軟件檢測蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS16.0進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料，兩組數(shù)據(jù)比較采用Student's T-test檢驗，多個樣本均數(shù)比較用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較則用LSD-t檢驗。以α=0.05 為檢驗水準。

2 結果

2.1 HUVEC的分離與鑒定 在倒置顯微鏡下觀察以酶消化法分離培養(yǎng)的HUVEC，發(fā)現(xiàn)細胞接種后生長迅速，貼壁生長，3～5 d即可融合成片，表現(xiàn)為鋪路石樣鑲嵌排列的單層生長(見圖1)。細胞形態(tài)呈梭形或多角形，邊界清楚，中間突起的部分，可見圓形或橢圓形細胞核，核仁1～2個。VEC的Ⅷ因子相關抗原抗體通過免疫熒光將細胞鑒定為HUVEC(見圖2)。

圖1 HUVEC光鏡下形態(tài)(×100)

圖2 Ⅷ因子相關抗原免疫熒光染色(×200)

2.2 HUVEC 培養(yǎng)液中的L-6、MCP-1含量 應用ELISA試劑盒進行檢測發(fā)現(xiàn)，IL-6、MCP-1的蛋白含量水平在4組間的差異顯著(P<0.05)。HUVEC 中IL-6、MCP-1的分泌明顯受到LPS影響(P<0.05)，TP預刺激后顯著抑制了LPS刺激HUVEC分泌IL-6、MCP-1的表達水平(P<0.05)，且高濃度TP預刺激組(LPS+TP2：40 mg/L)較低濃度預刺激組(LPS+TP1：5 mg/L)抑制效果更為顯著(P<0.05，見表1)。

表1 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測IL-6、MCP-1的含量

2.3 HUVEC內IL-6、MCP-1的蛋白表達 IL-6、MCP-1的蛋白表達水平在組間比較均有明顯差異(P<0.05)。LPS組、LPS+TP1組、LPS+TP2組的IL-6、MCP-1的蛋白表達量較陰性對照組高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而TP預刺激HUVEC 后，隨著TP濃度的增加，LPS誘導的細胞IL-6、MCP-1蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2，圖3)。

表2 蛋白質印跡法檢測HUVEC 中IL-6、MCP-1蛋白表達水平(n=3)

圖3 人臍靜脈內皮細胞IL-6、MCP-1蛋白表達水平

3 討論

隨著牙周醫(yī)學的發(fā)展，牙周疾病與全身系統(tǒng)性疾病(癌癥、心血管疾病、糖尿病等)的相關研究日益受到重視，而茶及其提取物TP通過研究認為可以減少罹患心血管疾病和癌癥的風險，成為近年來研究的熱點[9]。在治療心血管疾病中，TP可通過調節(jié)各種信號傳導途徑表現(xiàn)出抗炎、抗氧化和抑制血管內皮細胞功能障礙的作用[10]。相比于抗心血管疾病藥物，茶容易獲取且價格便宜，被認為是控制和管理心血管疾病的有效方法。然而，TP具有多種生物學和藥理學特性，其對心血管疾病的作用機制尚不完全明確。

大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，伴放線聚集桿菌和P.g等牙周主要致病菌可導致外周血中促炎細胞因子水平升高，其中包括與AS發(fā)病相關的IL-6、MCP-1等關鍵炎性標志物，炎性介質的高表達也增加了系統(tǒng)性炎癥和感染的風險[11]。Li等研究表明，LPS通過p44/42和p38 MAPK信號通路介導增強VEC釋放IL-6[12]，并可刺激VEC分泌MCP-1(也稱趨化因子配體2)，增強單核細胞的遷移能力并黏附至血管內皮表面[13]。

Cai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，體外實驗用Pg-LPS刺激小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW 264.7)，可提高IL-6及TNF-α的分泌水平，Pg-LPS刺激Apo E基因敲除(Apo E-/-)小鼠，可促進MCP-1、sICAM-1的表達增加。我們的實驗結果顯示：IL-6、MCP-1表達水平在陽性對照組(LPS)HUVEC內明顯上調(P<0.05)，且細胞外MCP-1、IL-6的變化趨勢與之相同，蛋白含量水平也相應上調。這反映了VEC可受到Pg-LPS的影響，導致促炎介質的表達增加，誘發(fā)機體局部炎癥反應和系統(tǒng)炎癥反應，促進AS的進展。

研究表明，不同濃度的TP，隨著劑量的增加，能依賴性地降低P.g誘導的口腔上皮細胞IL-6的表達水平[15]。TP中的活性物質EGCG可抑制P.g誘導的小鼠牙齦組織中TNF-α、IL-6、IL-17和IL-1β等細胞炎性因子的表達水平[16]。EGCG還可濃度依賴性的降低TNF-α誘導的MCP-1信使RNA及蛋白的表達水平，同時抑制單核細胞的黏附功能[17]。本實驗結果顯示：加入不同濃度TP(5、40 mg/L)預刺激HUVEC后，TP明顯抑制 Pg-LPS誘導的HUVEC的MCP-1、IL-6釋放及細胞內MCP-1、IL-6蛋白的表達水平。這些數(shù)據(jù)表明，TP能有效下調HUVEC炎性因子MCP-1、IL-6表達水平，降低細胞炎性損傷，對Pg-LPS誘導的內皮功能障礙具有保護作用。MCP-1及IL-6是引發(fā)心血管疾病的重要炎癥標志物，TP展現(xiàn)出對其顯著的抑制作用，使TP可能成為潛在的防治心血管疾病及牙周病的有效藥物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，TP可抑制Pg-LPS誘導的內皮細胞MCP-1、IL-6的表達水平，對VEC具有一定的保護作用，為今后TP的藥理作用及心血管疾病和牙周病防治的研究提供了一定的參考。但遺憾的是，本實驗研究是建立在體外細胞實驗模型上，沒有對體內生理狀態(tài)下TP的作用進行分析，TP在機體內是否具有同樣的功效還需要更多的研究闡明。