何亞瓊，尹春林，朱 夢(mèng)，謝少康，胡豐林

(1.皖北衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，安徽 宿州 234000；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 230036)

粉被蟲草(Cordyceps pruinosa Petch)，屬于子囊菌綱，肉座目，麥角科，蟲草屬，其無性型為馬利亞霉新種(Mariannaea pruinosa Liang sp.nov.)[1]。粉被蟲草具有抗紫外線輻射、抑制細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)、抗癌和抗炎等生物學(xué)活性[2-7]，利用NMR和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)對(duì)不同培養(yǎng)基和光照條件培養(yǎng)下的粉被蟲草代謝組進(jìn)行分析，共鑒定了5種醇、21種氨基酸、15種有機(jī)酸、4種嘌呤、3種嘧啶、7種糖、11種脂肪酸和5種其他代謝物[8]，可見將其作為保健品，具有良好的開發(fā)前景。代謝組學(xué)可分析生物體內(nèi)所有代謝物，通過生物信息化學(xué)、計(jì)量學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)掘其內(nèi)在聯(lián)系，研究生物體系的代謝過程及代謝途徑[9]。本研究采用基于HPLC-TOF-MS代謝組分析技術(shù)，比較人工培育的粉被蟲草菌絲體和孢梗束代謝差異，為后期的合理開發(fā)建立理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑Agilent 6210飛行時(shí)間高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析儀，購(gòu)于美國(guó)Agilent公司；分析型色譜柱Agilent poroshell 120 EC-C18(2.7μm，3.0mm×100mm)，購(gòu)于美國(guó)waters公司；電子天平(JA5103N)，購(gòu)于上海民橋精密科學(xué)儀器公司；FreeZone12冷凍干燥系統(tǒng)，購(gòu)于美國(guó)Labonconco公司；離心真空濃縮儀(RVC 2-25)，購(gòu)于德國(guó)Christ公司；數(shù)控超聲波清洗器(JK-300DB)，購(gòu)于合肥金尼克機(jī)械制造有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-70CF)，購(gòu)于上海知楚儀器有限公司；光照培養(yǎng)箱(DHP-90)上海一恒科學(xué)儀器有限責(zé)任公司。HPLC級(jí)甲酸、甲醇和乙腈，都購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司；純化水，購(gòu)于屈臣氏集團(tuán)有限公司。

1.2 菌株和培養(yǎng)粉被蟲草無性型-粉被馬利婭霉Mp09來自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

菌種培養(yǎng)：在超凈工作臺(tái)，用接種針挑取適量菌接種于SDAY培養(yǎng)基中(葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，瓊脂20g/L)，25℃培養(yǎng)7d。

液體培養(yǎng)：挑取適當(dāng)?shù)木N培養(yǎng)物接入SDY培養(yǎng)基(葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L)，25℃，150r/min培養(yǎng)3d。

固體培養(yǎng)：取10mL液體培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到糙米培養(yǎng)基(20g糙米加入40mL營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液：馬鈴薯200g/L、葡萄糖10g/L、麥芽糖10g/L、酵母份10g/L、蛋白胨10g/L、無水硫酸鎂1.5g/L、磷酸二氫鉀3g/L、檸檬酸三銨0.4g/L、復(fù)合維生素B4粒/L)，25℃黑暗培養(yǎng)，直到菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，然后全光照培養(yǎng)45d。培養(yǎng)7d時(shí)取其菌絲體備用，培養(yǎng)45d時(shí)取其孢梗束備用。

1.3 樣品處理將固體培養(yǎng)7d的菌絲體和45d的孢梗束分別刮入5mL離心管，放入液氮中冷凍，置于-80℃保存。菌絲和孢梗束凍干48h后，用粉碎機(jī)粉碎。分別稱取30mg凍干的菌絲和孢梗束，各加入3mL提取液(V氯仿∶V甲醇∶V水=1∶2.5∶1)和30μL內(nèi)標(biāo)Fmoc-glycine(1mg/mL)，超聲提取1h后4℃靜置12h。提取物1×104r/min離心10min，取2.8mL上清，真空濃縮干燥，置-80℃保存。HPLC-MS分析前用400μL 90%甲醇超聲復(fù)溶并經(jīng)0.22m濾膜過濾。以上樣品各做五個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 HPLC-MS分析色譜條件：進(jìn)樣體積2μL，柱溫40℃，流速0.3mL/min，流動(dòng)相：A=0.1%甲酸的水溶液，B=0.1%甲酸的乙腈，洗脫梯度：0～3min，3%B；3～50min，3～100%B；50～60min，100%B。

質(zhì)譜條件：干燥氣為N2，溫度350℃，流速12L/min，霧化氣壓35psi；毛細(xì)管電壓：陽(yáng)離子模式4000V，陰離子模式3500V；碎裂電壓：陽(yáng)離子模式215V，陰離子模式175V，錐孔電壓60V；質(zhì)量采集范圍：陽(yáng)離子模式80～1000Da，陰離子模式80～1100Da。

1.5 代謝物識(shí)別代謝物識(shí)別依據(jù)：(1)基于化合物質(zhì)譜特征、精確質(zhì)荷比及同位素模式識(shí)別計(jì)算分子式。該分子式與本實(shí)驗(yàn)室積累的昆蟲病原真菌天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)[Dictionary of Natural Products(DNP)、METLIN等]搜索匹配，確定差異化合物；(2)用代謝的質(zhì)量碎片與METLIN和MASSBANK中相同的或具有類似結(jié)構(gòu)的化合物的質(zhì)譜比對(duì)；(3)通過代謝物極性與其結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證；(4)查閱蟲生真菌代謝物文獻(xiàn)驗(yàn)證。

1.6 數(shù)據(jù)處理原始HPLC-MS數(shù)據(jù)通過MassHunter software中的Molecular Feature Extraction運(yùn)算進(jìn)行自動(dòng)峰檢測(cè)、色譜去卷積和去除信噪比小于5的雜質(zhì)峰等處理，最后導(dǎo)出每個(gè)樣品的峰列表。導(dǎo)出的數(shù)據(jù)上傳至MetaboAnalyst進(jìn)行峰對(duì)齊、歸一化等處理。使用SIMCA14.1進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析，使用MetaboAnalyst進(jìn)行t-test和one-way ANOVA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析主成分分析(Principal component analysis，PCA)是將質(zhì)譜分析所得的多維數(shù)據(jù)降低到一個(gè)二維空間，視覺直觀了解粉被蟲草菌絲體和孢梗束代謝物差異的整體情況。陽(yáng)離子模式(R2X=0.939，Q2=0.824)和陰離子模式(R2X=0.802，Q2=0.547)，數(shù)據(jù)均大于0.5，說明陰陽(yáng)離子模式下，模型構(gòu)建較好。圖1為HPLC-MS陰、陽(yáng)離子模式下粉被蟲草菌絲體組(JST)和孢梗束組(BGS)化合物差異的PCA-2D得分圖。其中A為總陰離子模式，前2個(gè)主成分可以對(duì)80.2%的變量進(jìn)行解釋，其中PC1=67.8%，PC2=12.4%；B為總的陽(yáng)離子模式，前2個(gè)主成分可以對(duì)90.76%的變量進(jìn)行解釋，其中PC1=86%，PC2=4.76%。從圖1可以看出，JST和BGS的積分矩陣圖可完全分離，說明JST和BGS之間代謝物存在明顯差異。

2.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)由于PCA是一種沒有監(jiān)督的分組方法，當(dāng)對(duì)樣品分組時(shí)出現(xiàn)分組內(nèi)部之間的差異大于組與組之間的差異時(shí)，這種分組方式就變得不夠清晰，此時(shí)，采用一種有監(jiān)督的分析方法十分必要。OPLS-DA是一種通過去除與分組無關(guān)的系統(tǒng)自身差異來篩選出代謝差異物，從而能夠使分離達(dá)到最大化[10]。OPLS-DA使用中，要求R2X≥0.5，R2Y≥0.5，Q2≥0.5；于此同時(shí)，還需要對(duì)PLS-DA進(jìn)行排列檢驗(yàn)，使用與OPLS-DA實(shí)驗(yàn)具有相同個(gè)數(shù)的成分(permutations，n=200)，當(dāng)截距Q2≤0.05，滿足上述條件表示該模型預(yù)測(cè)能力較好。S-plot主要用來獲得OPLS-DA分組后的樣品之間代謝差異物，其中P[1]≥|0.05|，P(corr)≥|0.5|；并且對(duì)所得結(jié)果經(jīng)過t-test，其中P<0.05的變量被認(rèn)為是和分組相關(guān)的顯著性差異物[11]。

本文采用BGS和JST兩相比較方式進(jìn)行分析，見圖2。所有模型中R2X≥0.5，R2Y≥0.5，Q2≥0.5；排列檢驗(yàn)中截距Q2≤0.05，則認(rèn)為這些模型未出現(xiàn)過擬合，較為可靠，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

OPLS-DA的得分圖顯示JST和BGS在OPLS1上可以明顯分開，兩組間的差異代謝物通過S-plot(a、b)識(shí)別，陰、陽(yáng)離子模式下共識(shí)別58個(gè)差異化合物，具體詳情見表1。

表1 BGS和JST在陰離子和陽(yáng)離子模式下識(shí)別的顯著性差異物

JST中含量較高的化合物主要有磷脂類物質(zhì)如PC(18∶0/0∶0)、PC(16∶0/0∶0)、PC(18∶1/0∶0)、PC(18∶2/0∶0)、PC(17∶2/0∶0)、PS(21∶1/0∶0)、PS(21∶0/0∶0)、PE(18∶1/0∶0)和Linoleylglycerol phosphate ethanolamine；鞘氨醇及其衍生物如militarinone C和phytosphingosine；肽類和氨基酸衍生物如allobeauvericin B、allobeauvericin C、Nα-dimethylcoprogen、Nα-dimethylcoprogen N-oxide、ferricrocin、schizokinen和citrifelin B；糖類物質(zhì)如D-glucopyranosyl-L-rhamnosel和4-O-Glucopyranosyl-D-gluconic acid，以及脂肪酸類物質(zhì)如hydroxy palmitic acid、palmitic acid、Linoleic acidh和8-oxo-9-octadecenoic acid等。相對(duì)JST，BGS中檢測(cè)到更多具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，如生物堿類、核苷類、萜類、酮類、酸酐等等。其中生物堿類化合物有daunomycin、ethoheptazine citrate、OPC、amino-eicosanediol和octadecenoic acid-2-amino-2-methyl-1-propanol；核苷類有N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine、decarboxydihydrocitrinone和adenine；萜類物質(zhì)有Austalide N；酮類化合物有cycloartobilxanthone和decahydroxy-biisoflavone；酸酐類化合物有ceramidastin等。

通過OPLS-DA中的S-plot圖獲得JST與BGS間的差異代謝物，這些差異代謝物主要包括磷脂類、肽類、糖類、脂肪酸、生物堿類、核苷類、糖苷類、酮類和鞘氨醇及其衍生物。

3 討論

基于液質(zhì)聯(lián)用的代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示：人工培養(yǎng)的粉被蟲草菌絲體和孢梗束代謝組差異顯著。二者具有不同的代謝譜，粉被蟲草菌絲體代謝物中有31個(gè)代謝物，其含量顯著高于孢梗束，其中磷脂類、肽類、氨基酸、脂肪酸和糖類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，因此菌絲可能具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。孢梗束中有27個(gè)代謝物含量較高，包括生物堿類、核苷類、萜類、酮類、酸酐等活性物質(zhì)，其中HEA、cycloartobilxanthone、ceramidastin等化合物具有抗紫外輻射、治療慢性腎間質(zhì)纖維化和糖尿病性腎病、抑制肺癌細(xì)胞遷移和治療細(xì)菌性皮炎等活性，可見孢梗束具有較大的藥用價(jià)值。

磷脂酰膽堿和鞘酯等化合物是重要營(yíng)養(yǎng)和保健物質(zhì)[12-16]，該類物質(zhì)在菌絲中含量較高，表明菌絲可能具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。菌絲中含量高的肽類化合物大多是鐵載體。鐵不僅是許多酶的輔助因子，還是電子運(yùn)輸系統(tǒng)中的催化劑，參與氧的運(yùn)輸、DNA的合成和電子轉(zhuǎn)移過程等代謝過程，參與細(xì)胞鐵積累與菌絲體著色[17-18]；研究還顯示氧化脅迫可導(dǎo)致Aspergillus nidulans細(xì)胞內(nèi)鐵載體Ferricrocin的積累[18]。菌絲中鐵載體含量的增加說明菌絲在生長(zhǎng)過程中可能受到了氧化脅迫，同時(shí)由于本研究培養(yǎng)基中沒有添加鐵試劑，可能導(dǎo)致菌體鐵元素不足，從而刺激菌體的營(yíng)養(yǎng)吸收器官(菌絲)合成更多鐵載體，以提高鐵吸收能力，提示在以后的培養(yǎng)中可適當(dāng)添加鐵試劑。

孢梗束中Daunomycin于1963年首次從S.peucetius中發(fā)現(xiàn)一種蒽環(huán)類抗生素，該化合物具有抗細(xì)菌、腫瘤和病毒活性[19]。N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine(HEA)，又名繭草菌素，該化合物于1983年從粉被蟲草在內(nèi)的17種蟲草菌絲體和6種棒束孢的水‐乙醇提取物中檢測(cè)到。早期研究顯示HEA具有較強(qiáng)的鈣離子拮抗、正性肌力和抗紫外輻射活性[20-21]。近年研究發(fā)現(xiàn)HEA還具有較強(qiáng)的抗炎和抗氧化活性，在治療慢性腎間質(zhì)纖維化和糖尿病性腎病方面具有較好的效果[3,22-23]。萜類物質(zhì)Austalide N最初是從土曲霉發(fā)酵液中分離得到的，對(duì)-葡萄糖苷酶有抑制作用[24]。酮類化合物cycloartobilxanthone不僅對(duì)P-388細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，還通過抑制遷移FAK和CDC42信號(hào)，減少遷移細(xì)胞的絲狀偽足，降低整聯(lián)蛋白5、v和3以及通過抑制EMT等方式抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲，具有一定的抗癌作用[25-26]。酸酐化合物ceramidastin是神經(jīng)酰胺酶抑制劑，對(duì)一些可以產(chǎn)生神經(jīng)酰胺酶而導(dǎo)致的細(xì)菌性皮炎具有一定的治療效果[27]。孢梗束中這些生物活性代謝物的存在充分說明了孢梗束可能具有較大的藥用潛力。目前在蟲草菌的實(shí)際應(yīng)用中，并不將孢梗束或子實(shí)體與其它部分分開應(yīng)用，從本研究結(jié)果來看，孢梗束與菌絲體的代謝成分具有較大差別，而化學(xué)成分是一切藥材的藥效基礎(chǔ)，因此孢梗束與菌絲體可能具有較大藥效差別，值得對(duì)這兩部分的藥效考察和應(yīng)用研究做進(jìn)一步的研究。