張宇航，熊金輝，何保江，郝菊芳，柏正武*

1.武漢工程大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 武漢430205；

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州450001；

3.中國煙草總公司職工進修學院，河南 鄭州450008

多糖分子具有高度有序的螺旋結(jié)構(gòu)，其衍生物可用來制備高效液相色譜的手性固定相（chiral stationary phase，CSP）［1-2］。在1973年，Hesse和Hagel［3］合成了微晶纖維素三乙酸酯，發(fā)現(xiàn)其在高效液相色譜中有一定的手性識別能力。而后，相繼出現(xiàn)了用各種不同纖維素酯制備高效液相色譜中CSP的報道［4-6］。目前，已商業(yè)化的CSP大多是用纖維素或直鏈淀粉的衍生物制備的。雖然將纖維素或直鏈淀粉衍生物涂覆在載體上得到的CSP有良好的手性分離性能，但這些衍生物溶于許多有機溶劑，或在這些溶劑中高度溶脹［7］，因而極大地縮小了流動相的適用范圍。故此，發(fā)掘?qū)τ袡C溶劑耐受性和手性分離能力都很強的多糖衍生物固定相仍然是一項重要的研究工作。

因與纖維素有相似的一級結(jié)構(gòu)，近幾年殼聚糖也被用來制備手性分離材料［8-10］。而且發(fā)現(xiàn)一些用殼聚糖-3，6-二（芳香基氨基甲酸酯）-2-酰胺和殼聚糖-3，6-二（芳香基氨基甲酸酯）-2-脲制備的CSP有很好的手性識別能力，且在絕大多數(shù)流動相中有很好的耐受性能［11-13］。相較于纖維素-三（苯甲酸酯）和纖維素-三（苯基氨基甲酸酯），殼聚糖衍生物2-位上是酰胺或脲，而不是氨基甲酸酯，酰胺或脲應該形成了更強的氫鍵，使相應的衍生物難以溶解于一般的有機溶劑。因此，用殼聚糖衍生物制備CSP能提高其對流動相的耐受性能。在本文工作中，用殼聚糖（脫乙酰度約為98.3%）制備一種新的手性選擇體（chiral selector，CS），即殼聚糖-3，6-二（3，5-二甲基苯甲酸酯）-2-芐基脲（CS1），并將其涂覆于7μm的大孔氨丙基硅膠上，制備成CSP1，討論流動相的組成以及外消旋體的結(jié)構(gòu)對CSP1手性分離能力的影響。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖按文獻［14-15］方法制備，其粘均分子量為1.4×105［16］，以1H NMR測得脫乙酰度約為98.3%；3，5-二甲基苯甲酰氯（阿拉丁試劑有限公司）；芐胺（安耐吉化學）；N，N-二甲基乙酰胺（N，N-dimethylacetamide，DMAc）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）等其它試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

紅外光譜儀（Bruker TENSOR 27，德國Bruker公司）；元素分析儀（Elemental Vario EL III CHNOS，德國Elementar公司）；核磁共振儀（Bruker AVANCE III 600 MHz，瑞士Bruker公司）；高效液相色譜儀（Waters e 2695，美國Waters公司）。

1.2 手性選擇體的制備

將1.50 g（9.32 mmol重復單元）殼聚糖加入到20 g 0.8%（質(zhì)量分數(shù)）的稀鹽酸中，攪拌至完全溶解后加入約20 g甲醇。冰水浴冷卻，當溶液溫度低于8℃時，加入2.02 g（18.61 mmol）氯甲酸乙酯。8℃下反應15 min后，再間歇加入1.88 g（18.60 mmol）三乙胺與10 g甲醇的混合溶液，使反應體系的pH值維持在6～7之間，再于4～5℃下攪拌7 h。將反應混合物傾入乙醇溶液中，攪拌2 h，過濾，用乙醇洗至中性，干燥，得乙氧基羰基殼聚糖，產(chǎn)率：86%。此產(chǎn)物未經(jīng)純化可直接用于下一步反應。

取1.50 g干燥的氯化鋰溶于干燥的15 mL DMAc中，在80℃下加入1.00 g（4.27 mmol重復單元）乙氧基羰基殼聚糖，待溶解后冷卻至室溫。向溶液中加4.61 g（43.02 mmol）芐胺，攪拌均勻后將反應液倒入反應釜中，以4-二甲氨基吡啶為催化劑，120℃下反應12 h。將粗產(chǎn)物與乙醇相混合，碾碎凝膠狀固體，用乙醇反復洗滌，干燥，得到殼聚糖-芐基脲，產(chǎn)率：93%。1H NMR（600 MHz，CF3COOD，25℃，δ）：7.80～7.19（5H，Ph-H），5.37～3.50（9H，氨基葡萄糖骨架H和芐基中的CH2）；IR（KBr，cm-1）υ：3 472，3 336（-OH，-NH-），3 064，3 030，795，745（Ph-），2 929，2 872（-C-H），1 645～1 566（-CONH-）；EA（%）：Calcd（C14H18N2O5·0.9H2O）nC：54.15，H：6.43，N：9.02，F(xiàn)ound C：54.62，H：6.54，N：8.49。

取2.00 g干燥的氯化鋰溶于20 mL干燥的DMAc中，在90℃下加入1.50 g（5.34 mmol重復單元）殼聚糖-芐基脲和催化量的4-二甲氨基吡啶，攪拌使之完全溶解。向此溶液中加入4.33 g 3，5-二甲基苯甲酰氯（25.68 mmol），攪拌約15 min后，再加入2.60 g三乙胺（25.69 mmol），于90℃下反應30 h。反應結(jié)束后，先過濾除去反應液中的三乙胺鹽酸鹽，再將澄清濾液逐滴滴加到200 mL甲醇中，得到白色沉淀。將干燥后的固體溶解在20 mL DMF中，用150 mL甲醇重沉淀。反復重沉淀，直至濾液經(jīng)薄層色譜檢測顯示無殘留物質(zhì)為止。將固體干燥至恒重，得到殼聚糖-3，6-二（3，5-二甲基苯甲酸酯）-2-芐基脲，即CS1，產(chǎn)率：74%。IR（KBr，cm-1）υ：3 391～3 316（-CONH-），3 100，2 949，2 928（-C-H），1 724，1 268（-CO-），1 603（-Ph）；EA（%）：Calcd（C32H34N2O7·1.2H2O）nC：66.24，H：6.32：N：4.83，F(xiàn)ound C：65.49：H：6.70：N：5.67。

1.3 手性固定相的制備與填充

按照文獻方法［11］，將CS1以質(zhì)量分數(shù)20%涂覆在3-氨基丙基硅膠上［17］，制備成CSP1。本文所涉及的色譜參數(shù)包括：容量因子（k），分配因子（α）和分離度（Rs）。k1=（t1-t0）/t0，k2=（t2-t0）/t0，α=k2/k1，Rs=2（t2-t1）/（w1+w2），其中t0為1，3，5-三叔丁基苯的保留時間，t1和t2分別是先后被洗脫的對映體的保留時間，w1和w2是兩對映體的峰底寬。k反映CSP與分析物相互作用的強弱，α及Rs則反映CSP的分離性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖衍生物的表征

殼聚糖與氯甲酸乙酯反應后生成了乙氧基羰基殼聚糖，在其IR譜圖上出現(xiàn)了乙氧基羰基（1 704 cm-1）和酰胺Ⅱ帶（1 555 cm-1）的吸收峰，而在1 750 cm-1附近未出現(xiàn)酯羰基峰，說明氯甲酸乙酯只選擇性地與殼聚糖中的氨基反應，不與羥基反應。殼聚糖-芐基脲的紅外光譜圖出現(xiàn)酰胺Ⅰ（1 645 cm-1）和酰胺Ⅱ（1 566 cm-1）的特征吸收峰，乙氧基羰基峰消失，證明胺酯交換反應較徹底。圖1為殼聚糖-芐基脲的1H NMR譜圖，圖中化學位移δ=5.37～3.50處的峰為殼聚糖骨架的質(zhì)子峰和芐基上亞甲基的質(zhì)子峰，δ=7.80～7.19處的峰為芐基中苯環(huán)上的質(zhì)子峰，這兩組峰的積分面積比約為9∶5，而氯甲酸乙酯和芐胺只選擇性地與殼聚糖的氨基反應，因此可認為殼聚糖-芐基脲幾乎為完全脲基化產(chǎn)物?？紤]到殼聚糖-芐基脲的吸濕性，殼聚糖-芐基脲元素分析的擬合值分別是C：54.15，H：6.43，N：9.02，而實際測得值為C：54.62，H：6.54，N：8.49，兩者相吻合。相似地，所制備的殼聚糖-3，6-二（3，5-二甲基苯甲酸酯）-2-芐基脲的元素分析擬合值與其實測值也相吻合。

圖1殼聚糖-芐基脲的1H NMR譜圖（600 MHz，CF3COOD，25℃）Fig.1 1H NMR spectrum of chitosan benzylurea（600 MHz，CF3COOD，25℃）

2.2 CSP1的手性分離性能

以聯(lián)苯為分析物，用高效液相色譜測得填充著CSP1色譜柱的對稱因子為1.06，柱效為3.23×104理論塔板數(shù)/米。用19種手性化合物（圖2）為樣品，在三種流動相中對CSP1的手性識別性能進行了評估，分離結(jié)果如表1所示。由表1可知，CSP1共識別了13個手性樣品（α＞1.0），基線分離了其中的9個（Rs≥1.50）。如手性樣品7、9和11的對映體在CSP1上均得到較好的分離，其色譜圖如圖3所示。

多糖衍生物類CSP能識別手性化合物對映體的關(guān)鍵原因是手性選擇體（本文中的CS1）與手性化合物之間存在π-π、氫鍵、偶極-偶極和空間位阻等相互作用，以及多糖衍生物本身所具有的高度有序的螺旋結(jié)構(gòu)。手性化合物上的取代基對手性識別有很大的影響，如與2號化合物相比，18號化合物的苯環(huán)對位上多了一個甲基，18號化合物能在CSP1上得到基線分離，而2號化合物僅能被識別，這可能是因為甲基增強了羰基中氧原子的電子云密度，18號化合物更容易與CS1形成氫鍵，使18號化合物在CSP1上的分離度更大。對于含有苯甲醇結(jié)構(gòu)的手性化合物，CSP1不能識別8、13、15、16號化合物，但是卻能基線分離11號化合物，這可能是由于11號化合物中咪唑環(huán)上的氮原子與CS1中的酰胺形成較強的氫鍵所致。此外，CS1螺旋結(jié)構(gòu)的形狀及大小與手性樣品分子是否匹配對手性識別也應有影響。

2.3 流動相對手性分離性能的影響

從分離結(jié)果可看出，CSP1在正己烷/乙醇（90/10，體積比，下同）流動相中的手性分離能力最強，能夠識別12個手性化合物對映體，基線分離9個；在正己烷/乙醇/甲醇（90/5/5）流動相中分離能力較差，僅識別8個手性化合物對映體，基線分離5個；大多數(shù)手性化合物對映體在正己烷/異丙醇（90/10）中的分離度最大，這可能是由流動相中醇的黏度和極性不同引起的。異丙醇黏度較大，使手性樣品擴散速度變慢，對手性樣品與CS1之間的相互作用有利，而當流動相的極性增強時（如含甲醇），手性樣品與流動相之間的作用也增強，這就減弱了手性樣品與CS1之間的相互作用。從表1中可以看出，手性樣品在CSP1上的k1值隨流動相的黏度降低和極性增強而減小，這一現(xiàn)象與上述的推論相符合，只有手性樣品與CS1之間有足夠的相互作用，才有可能發(fā)生手性識別。因此，對于相同的手性樣品在不同的流動相的條件下會有不同的分離結(jié)果，如在CSP1上，1號、3號、17號和18號在正己烷/異丙醇（90/10）和正己烷/乙醇（90/10）中都能被識別，甚至基線分離，而在正己烷/乙醇/甲醇（90/5/5）中不能被識別。

圖2手性化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structures of chiral analytes

表1 CSP1的手性分離性能Tab.1 Enantioseparation capability of CSP1

圖3分析物7、9和11號在CSP1上的分離色譜圖［流動相：正己烷/乙醇（90/10）］Fig.3 Chromatograms of analytes 7，9 and 11 separated by CSP1［Mobile phase：n-hexane/ethanol（90/10）］

3 結(jié)論

本文選擇性地修飾殼聚糖上的氨基得到殼聚糖-芐基脲，再用3，5-二甲基苯甲酰氯修飾殼聚糖-芐基脲上的羥基，制得一種新的手性分離材料，即殼聚糖-3，6-二（3，5-二甲基苯甲酸酯）-2-芐基脲。用這種殼聚糖衍生物為手性選擇體，將其涂覆在3-氨基丙基硅膠上制成CSP1，在3種正相模式下，用高效液相色譜分離19種手性分析物對映體，以此評價其手性分離能力。結(jié)果顯示CSP1對化合物6、11和19等藥物或藥物中間體，以及一些含酰胺和脲基官能團的化合物（如化合物1、17和18）有很好的分離性能，而對含1-苯基乙醇結(jié)構(gòu)的手性化合物分離效果相對較差。比較在不同流動相條件下CSP1對19種手性化合物的分離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在正己烷/乙醇（90/10）中CSP1的手性分離性能最好，而在正己烷/異丙醇（90/10）中的分離度最大。