吳冬梅,張曉東

(1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)以持續(xù)無排卵、高雄激素含量和胰島素抵抗為特征[1-3]。PCOS患者主要表現(xiàn)為胰島素抵抗(insulin resistance,IR) 和代償性高胰島素血癥，是引起月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)和不孕的常見原因之一，還與其他心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-5]。遺傳因素、下丘腦-垂體-性腺軸功能失調(diào)、卵巢及腎上腺功能異常、胰島素抵抗、肥胖[6]都與PCOS的發(fā)病有聯(lián)系。脂肪組織是人體重要的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器，是觸發(fā)胰島素抵抗炎癥反應(yīng)的重要場所，脂肪組織分泌功能紊亂在IR中扮演了重要的角色。荷葉是一種被廣泛研究的植物化學(xué)物，但其對前脂肪細胞增殖、分化、凋亡的影響，以及相關(guān)機制仍不明確。本研究檢測荷葉對3T3-L1脂肪細胞的影響，以期從分子生物學(xué)角度闡述荷葉降脂的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

荷葉，購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，水煮提取，高壓滅菌，制備中藥水溶性提取物(extracts of Chinese medical herbs,ECMH)，4 ℃?zhèn)溆谩MEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司產(chǎn)品，批號12100046；胰蛋白酶(批號20160302)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，批號20150120)，均為北京Solarbio公司產(chǎn)品；熒光定量 PCR Mix(批號A25741)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號18090050)，均為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；TRIZOL試劑，美國Invitrogen 公司產(chǎn)品，批號15596026；胰島素(批號I0516)、地塞米松(DEX，批號D4902)、 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，批號17018)、油紅O(批號O0625)，均為美國Sigma公司產(chǎn)品。96孔細胞培養(yǎng)板，美國Costar公司產(chǎn)品，批號3516；OLYMPUS CK40 倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司產(chǎn)品；高速臺式冷凍離心機，德國Herseus公司產(chǎn)品；ABI7300熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水儀，美國Milipore公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代

3T3-L1細胞，購自上海細胞所。將 3T3-L1細胞在含有100 IU/L青霉素100 mg/L鏈霉素、體積分數(shù)100 mL/L 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、體積分數(shù)50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。生長至90%傳代培養(yǎng)。取傳代2～3代后的細胞進行種板并進行后續(xù)實驗。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞增殖的影響

采用MTT法檢測。細胞以1×105/mL密度接種到96孔板上，培養(yǎng)24 h至生長融合后將細胞分為正常對照組和質(zhì)量分數(shù)為0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的荷葉水提物組。正常對照組細胞進行正常培養(yǎng)；荷葉水提物各組以質(zhì)量分數(shù)為0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的荷葉水提物分別刺激3T3-L1前體脂肪細胞24 h，再更換含5 g/L MTT液無血清培養(yǎng)基90 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度。

1.3.2 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞和成熟脂肪細胞白介素-6(IL-6)信使核糖核酸(mRNA)、腫瘤壞死因子(TNF-α)mRNA的表達

采用熒光定量PCR檢測。將細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，融合達到90%后隨機分2組。荷葉組：加入5 mL含1g/L的荷葉提取物。正常對照組：加入5 mL 普通培養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，處理結(jié)束后提取RNA；誘導(dǎo)分化的成熟脂肪細胞培養(yǎng)至第9天時按以上方法分組并加藥，培養(yǎng)24 h后清洗細胞，提取細胞RNA。所得各組RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，熒光定量PCR儀進行擴增。實時熒光定量反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性90 s；進入PCR循環(huán)，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。擴增反應(yīng)結(jié)束后，從65 ℃緩慢加熱到95 ℃，以建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，每個標(biāo)本均設(shè)置復(fù)管PCR反應(yīng)。以GADPH為內(nèi)部對照，采用2-ΔΔCt相對定量法計算各組基因表達得出RQ 值進行計算和統(tǒng)計。

1.3.3 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡的影響

采用DAPI染色法檢測。DAPI染色常用于細胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察。正常的細胞核呈亮藍色熒光，細胞質(zhì)無熒光。細胞發(fā)生凋亡時，細胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染。方法如下：取對數(shù)生長的細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化成細胞懸液，接種到預(yù)先放置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，置37 ℃、體積分數(shù)為50 mL/L CO2的孵箱中培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，進行分組。正常組：加入5 mL 含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。實驗組：加入5 mL含1 g/L的荷葉提取物。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取出蓋玻片，PBS漂洗2次;加入DAPI飽和工作液60 μL ，室溫避光作用10 min；PBS溶液洗滌3次，5 min/次；封片,在熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞增殖的影響

見表1。各質(zhì)量分數(shù)的荷葉提取物均可不同程度地抑制細胞的增殖，且呈現(xiàn)量-效關(guān)系。與正常對照組對比,各荷葉提取物組的OD值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)合10 g/L的荷葉水提物組出現(xiàn)皺縮、脫壁、細胞脫落現(xiàn)象，決定取質(zhì)量分數(shù)為1 g/L的荷葉水提物進行后續(xù)實驗。

表1 不同質(zhì)量分數(shù)荷葉水提對3T3-L1前體脂肪細胞增殖的影響

2.2 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞和成熟脂肪細胞 TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達的影響

質(zhì)量分數(shù)1 g/L的荷葉水提物能降低3T3-L1前體脂肪細胞IL-6 mRNA 表達，能增高3T3-L1成熟脂肪細胞TNF-α、IL-6 mRNA的表達 ，與正常對照組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 荷葉水提物對前體脂肪細胞和成熟脂肪細胞 TNF-α mRNA和IL-6 mRNA表達的影響

2.3 荷葉水提物對3T3-L1前體脂肪細胞凋亡的影響

見圖1。正常對照組細胞在細胞核處發(fā)散微弱熒光，質(zhì)量分數(shù)1 g/L的荷葉水提物組可見細胞凋亡。凋亡細胞的細胞核縮小、發(fā)散高亮熒光；細胞漿中可見局部稀疏亮點(線粒體DNA)。早期凋亡的細胞有明亮凋亡熒光。

A.正常對照組

B.1 g/L荷葉水提物組

3 討 論

多囊卵巢綜合征患者存在代謝異常，主要表現(xiàn)為肥胖、胰島素抵抗、糖耐量損害和血脂異常等。PCOS的高雄激素血癥及高胰島素可改變脂蛋白及膽固醇的代謝而產(chǎn)生高脂血癥，加重脂類代謝的異常，進一步導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生[10]。脂肪組織在人體中是一個重要的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)器，脂肪蓄積過多可能導(dǎo)致胰島素抵抗。肥胖癥與糖尿病、冠心病、高血壓、脂代謝紊亂及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重影響著人們的身心健康。脂肪組織的變化是肥胖癥發(fā)生的根本原因，脂肪組織能分泌一些特異性蛋白，在機體糖脂代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用，此成為治療肥胖癥的新靶點。IL-6是多功能炎性細胞因子,具有致炎和抗炎的雙向功能，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。其作用與組織中的含量有關(guān),正常水平的白介素對機體有利,過多則會引起炎性損害。

MTT實驗結(jié)果顯示：0.001,0.01,0.1,1,10 g/L的ECMH可不同程度抑制脂肪細胞的增殖，隨著藥物質(zhì)量分數(shù)的升高，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與正常對照組對比，各質(zhì)量分數(shù)的荷葉水提物都可以不同程度抑制細胞增殖，且質(zhì)量分數(shù)越高，對脂肪細胞的抑制作用越強。但荷葉水提物質(zhì)量分數(shù)過高，會使脫落細胞增多，因此實驗中選取1 g/L的ECMH進行熒光定量PCR實驗。熒光定量PCR結(jié)果顯示：1g/L的荷葉水提物能降低3T3-L1前體細胞IL-6 mRNA的表達，增高成熟脂肪細胞TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表達。DAPI染色實驗結(jié)果顯示：荷葉水提物可以顯著促進脂肪細胞的凋亡。