Nazarenko Yulia李 波楊 偉*

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.蘇梅國立農(nóng)業(yè)大學(xué)食品技術(shù)學(xué)院,烏克蘭蘇梅 40021)

蛋白質(zhì)自組裝是指蛋白質(zhì)分子間,在熱力學(xué)平衡條件下,通過建立特異性或非特異性相互作用,自發(fā)形成有序結(jié)構(gòu)的過程[1]。它無需外部能量輸入,僅通過改變介質(zhì)環(huán)境就可以觸發(fā)或“拆卸”組裝[1]。在單一蛋白質(zhì)體系中,溶液pH環(huán)境接近蛋白質(zhì)等電點(pI)時,蛋白質(zhì)分子之間可發(fā)生自組裝[2-3];在含有兩種蛋白質(zhì)的體系中,蛋白質(zhì)可以在兩蛋白質(zhì)pI之間的pH環(huán)境下發(fā)生自組裝[4-5]。形成的超分子結(jié)構(gòu)可以使蛋白質(zhì)在相關(guān)領(lǐng)域中具有包埋、保護和傳遞生物活性物質(zhì)的功能[6]。Anne等發(fā)現(xiàn):帶相反電荷的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)和乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)能夠自組裝,所形成的自組裝體具有作為維生素B9生物載體的潛力,每克蛋白最高可包埋16 mg B9[7];Fatoumata等利用BLG和溶菌酶之間的靜電相互作用組裝形成微球狀超分子結(jié)構(gòu)組裝體,并成功的將維生素D3包埋在BLG-溶菌酶微球中,包埋率高達90.8%±4.8%[8]。

LF是從牛奶初乳中分離出來的一種鐵結(jié)合糖蛋白[9],分子量為88 kDa,具有抗菌、抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能[10-14]。LF具有8.9的等電點(pI),在低于其pI的pH環(huán)境下帶正電荷,可以與具有負電荷的蛋白質(zhì)形成各種超分子結(jié)構(gòu)。Anema等利用這個特性研究了LF與BLG在pH5～7條件下(該溶液pH介于兩蛋白質(zhì)pI,8.9和4.6之間)形成的超分子結(jié)構(gòu)[15]。深入研究基于LF為載體的傳遞體系,對于開發(fā)新型多功能食品添加劑和配料具有重要意義。

α-乳白蛋白(α-lactalbumin,ALA)是乳清蛋白中的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),約占乳清總蛋白的20%(w/w),與BLG一樣,也具有較低的等電點(pI在4.2～4.5之間),但相比于BLG更易吸收[16]。推測LF和ALA也能夠在兩個蛋白質(zhì)等電點之間的pH條件下自組裝,形成不同的超分子結(jié)構(gòu),從而擴展LF-ALA復(fù)合物在食品領(lǐng)域中包埋、運載和傳遞生物活性物質(zhì)的功能。但目前,尚無LF-ALA復(fù)合物結(jié)構(gòu)和組裝機制的相關(guān)報道,這限制了其作為活性物質(zhì)載體的開發(fā)和應(yīng)用。

雙蛋白組裝體的結(jié)構(gòu)與功能與參與組裝的單一蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[17]。目前,雙蛋白自組裝的研究多集中在天然蛋白質(zhì)間的組裝。LF具有兩葉基團(N-葉和C-葉),當(dāng)在90 ℃加熱時,兩葉完全展開[18]。Yang等研究了熱變性前后LF和(-)-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG)之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)LF熱變性前后與EGCG的結(jié)合能力不同[19]。因此,推測熱變性LF與ALA自組裝復(fù)合物具有與天然LF與ALA自組裝復(fù)合物不同的結(jié)構(gòu)。這些不同的結(jié)構(gòu)對于擴展復(fù)合物的應(yīng)用具有重要意義。但是目前尚無相關(guān)研究報道。

因此,本文在pH6.5環(huán)境下探究了熱變性前后的LF與天然ALA的自組裝行為。采用多重光譜法研究了LF-ALA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特性及形成機制,為基于雙蛋白復(fù)合物運載活性物質(zhì)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LF 新西蘭國際有限公司，純度≥92%;ALA 美國Agropur公司，純度≥95%;溴化鉀 上海麥克林生化科技有限公司;磷酸二氫鉀 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;磷酸氫二鉀 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;其它所用化學(xué)藥品 均為國產(chǎn)分析純。

ALPHA1-2 LD plus真空凍干機 德國CHRIST凍干機有限公司;2100N濁度計 美國HACH公司;Zetasizer Nano-ZS90激光粒度儀 英國Malvern公司;Axio Vert.A1倒置生物顯微鏡 德國Zeiss公司;Cary-Eclipse熒光分光光度計 美國Agilent公司;SpectrumTensor27傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)合物的制備 母液配制:在pH=6.5、20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中,分別配制0.5 mmol/L LF溶液和5 mmol/L的ALA溶液,室溫下攪拌2 h,使蛋白質(zhì)充分水合。天然LF和天然ALA分別記為LF25 ℃和ALA25 ℃。室溫為25 ℃。

熱變性LF溶液的制備:首先,在超純水中配制1.0 mmol/L LF溶液,室溫下攪拌2 h,使蛋白質(zhì)充分水合。然后,將上述溶液置于90 ℃恒溫水浴下熱處理30 min后,立即在冰水中冷卻至室溫,以防止進一步變性。之后,再添加等體積pH=6.5、40 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液。此時得到了溶液環(huán)境為pH=6.5、20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液、濃度為0.5 mmol/L的熱變性LF溶液。熱變性LF記為LF90 ℃。

LF-ALA復(fù)合物制備:取一定體積的0.5 mmol/L LF25 ℃溶液,分別與不同濃度的ALA25 ℃溶液等體積混合,得到LF25 ℃濃度為0.25 mmol/L,ALA25 ℃濃度分別為0.125、0.25、0.5、0.75、1.25、1.75和2.5 mmol/L的LF25 ℃和ALA25 ℃自組裝復(fù)合物,記為LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物。采用相同方法,將0.5 mmol/L LF25 ℃溶液換成0.5 mmol/L LF90 ℃溶液,制備得到LF90 ℃和ALA25 ℃自組裝復(fù)合物,記為LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物。

1.2.2 ζ-電位的測定 采用Zetasizer Nano-ZS90測定LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的ζ-電位。測定溫度25 ℃。

1.2.3 濁度的測定 采用HACH 2100N濁度計測定LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的濁度。濁度儀采用90 °散射光原理，在入射光恒定條件下，散射光強度與溶液的渾濁度成正比。測定溫度25 ℃。

1.2.4 粒徑的測定 采用Zetasizer Nano-ZS90測定LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的粒徑大小，同時用多分散指數(shù)(PDI)表示粒徑分布。測定溫度25 ℃。

1.2.5 光學(xué)顯微鏡觀察 采用Axio Vert.A1倒置生物顯微鏡觀察LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物(其中ALA25 ℃的濃度為0.75 mmol/L)的形貌。放大倍數(shù)為1000倍。

1.2.6 熒光光譜測定 使用Cary-Eclipse熒光分光光度計進行熒光測量。激發(fā)波長設(shè)為292 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm,記錄發(fā)射波長300～500 nm范圍的熒光光譜[20]。

1.2.7 紅外光譜測定(FTIR) 將LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物(其中ALA25 ℃的濃度為0.75 mmol/L)置于-20 ℃下冷凍過夜后,使用真空凍干機將其冷凍干燥24 h,所得固體粉末按照1∶100的比例與溴化鉀混合,制成透明薄片,進行FTIR分析。測定波數(shù)為500～4000 cm-1,掃描11次,分辨率為4 cm-1[21]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實驗均重復(fù)兩次,每個樣品均檢測三組數(shù)據(jù),結(jié)果用平均值M±標(biāo)準(zhǔn)差SD表示。利用SPSS 18.0軟件,采用Duncan法對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。利用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 電位分析

ζ-電位是判斷溶液中蛋白質(zhì)電荷特性的重要指標(biāo),也是判斷蛋白質(zhì)與其它物質(zhì)是否結(jié)合的重要依據(jù)。圖1為不同ALA25 ℃濃度條件下,LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的ζ-電位。LF25 ℃溶液和LF90 ℃溶液的ζ-電位分別為-3.36和-0.30 mV。這與Zhao等在相似pH環(huán)境下測得LF的ζ-電位為(+5.0±0.6) mV不同[22],推測LF上的陽離子基團吸附溶液中的陰離子磷酸鹽所致[23]。這與Tokle等的報道一致[24]。

圖1 ALA濃度對LF-ALA復(fù)合物電位的影響Fig.1 Influence of ALA concentration on theζ-potential of LF-ALA complexes

隨著ALA濃度的增加,LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物ζ-電位始終呈現(xiàn)下降趨勢。Tokle等指出:LF對磷酸鹽離子的吸附行為并不影響LF與陰離子物質(zhì)的靜電吸引作用[24]。這表明ALA可能吸附在LF的表面[25]。通常,溶液中顆粒帶電荷越多,斥力越大,顆粒間聚集的可能性越小,溶液越穩(wěn)定。圖中LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的ζ-電位始終低于LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物,這說明LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的穩(wěn)定性較高。

2.2 濁度分析

濁度法是研究蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象最直接、簡便的方法,通過測量溶液中LF-ALA復(fù)合物的濁度能夠直觀評價溶液中LF和ALA的聚集行為[26]。圖2為不同ALA25 ℃濃度條件下,LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的濁度。

圖2 ALA濃度對LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物(a)、LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物(b)濁度的影響Fig.2 Influence of ALA concentration on the turbidity ofLF25 ℃-ALA25 ℃ complexes(a)、LF90 ℃-ALA25 ℃ complexes(b)

對于LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物,隨著ALA濃度的增加(0～0.75 mmol/L),LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的濁度增加(盡管增加程度很小),這表明LF25 ℃與ALA25 ℃發(fā)生了相互作用,導(dǎo)致其濁度增加[27]。ALA濃度為0.75 mmol/L時,LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的濁度達到最大值2.3 NTU;隨著ALA濃度繼續(xù)增加(0.75～2.5 mmol/L),濁度開始下降。這表明,此時溶液中的ALA過量,導(dǎo)致溶液中沒有足夠的LF與之結(jié)合;同時,由于越來越多的ALA吸附到LF表面,使得復(fù)合物表面負電荷增加(見圖1),靜電斥力增強,進而使溶液濁度降低[28]。

對于LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物,其濁度變化趨勢與LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物一致,均隨著ALA25 ℃濃度的增加,呈現(xiàn)先增加后下降的變化規(guī)律。不同的是,當(dāng)ALA25 ℃濃度為0.75 mmol/L時,LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的濁度高達270.4 NUT。這可能是由于熱處理引起LF結(jié)構(gòu)變化,LF90 ℃分子間較之LF25 ℃分子間更易于聚集[29];當(dāng)與ALA25 ℃結(jié)合后,LF90 ℃分子間的聚集傾向更加明顯,進而導(dǎo)致形成了超分子結(jié)構(gòu),使光散射強度增強,溶液濁度迅速增加。在LF與BLG[15]、溶菌酶和BLG[8]組裝過程中,均觀察到相似的濁度變化規(guī)律。

基于上述分析,推測LF90 ℃與ALA25 ℃可能通過以下機制進行結(jié)合。即:當(dāng)ALA25 ℃物質(zhì)的量比較低時,ALA25 ℃可作為多齒配體將兩個LF90 ℃分子橋聯(lián),形成-(LF90 ℃-ALA25 ℃-LF90 ℃-ALA25 ℃)n-結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)聚集體。但是,由于ALA25 ℃濃度較低,此時所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較小。所以,盡管溶液濁度增加,但不至于引起沉淀。隨著ALA25 ℃物質(zhì)的量進一步增加,溶液中有足夠多的ALA25 ℃參與橋聯(lián)作用,使得網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進一步增加,進而形成了顆粒較大的聚集體,溶液濁度增加,甚至產(chǎn)生沉淀。當(dāng)ALA25 ℃物質(zhì)的量繼續(xù)增加,過量的ALA25 ℃占據(jù)了LF90 ℃表面的結(jié)合位點,導(dǎo)致橋聯(lián)作用減弱,復(fù)合物出現(xiàn)復(fù)溶現(xiàn)象,濁度降低。Siebert等指出,蛋白質(zhì)和多酚相互作用過程中,隨著多酚濃度的增加,也存在濁度先增加后減小的現(xiàn)象,同時,將濁度減小歸因于復(fù)溶現(xiàn)象[30]。這兩種機制之間的關(guān)系需要進一步深入研究。

2.3 粒徑分析

粒徑的測量是一種光散射方法,它依賴于散射粒子的濃度、大小、折射率和入射波長,通過測量溶液中LF-ALA復(fù)合物的粒徑大小及多分散性(PDI)變化,可以更深入地了解LF與ALA形成的超分子結(jié)構(gòu)。圖3為LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的粒徑、PDI隨ALA25℃濃度的變化曲線。

圖3 ALA濃度對LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物(a)、LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物(b)粒徑與PDI的影響Fig.3 Influence of ALA concentration on theparticle size and PDI of LF25 ℃-ALA25 ℃complexes(a),LF90 ℃-ALA25 ℃ complexes(b)

由圖3可知,與LF25 ℃(16.33±0.52 nm)相比,LF90 ℃(215.8±20.64 nm)的粒徑較大,表明在磷酸鹽緩沖溶液中,LF90 ℃較之LF25 ℃具有更強的自聚集能力。這也解釋了LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物濁度較高的原因。隨著ALA25 ℃濃度的增加,LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的粒徑與濁度變化趨勢一致,均先增加后減小。LF25 ℃與ALA25 ℃形成的復(fù)合物為納米顆粒。當(dāng)ALA25 ℃濃度為0.75 mmol/L時,LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物粒徑最大,為(35.24±0.82) nm。LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物多為微米顆粒。當(dāng)ALA25 ℃濃度為0.75 mmol/L時,LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的粒徑也最大,為(4.11±0.14) μm;隨著ALA25℃濃度的進一步增加,LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的粒徑開始下降。需要指出的是,當(dāng)ALA25 ℃濃度為2.5 mmol/L時,LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的粒徑為(591.6±66.5) nm,為亞微米顆粒。這一結(jié)果表明:可以通過改變ALA的濃度來調(diào)控LF-ALA復(fù)合物的結(jié)構(gòu),進而得到納米級、亞微米級和微米級顆粒。

PDI值是評價顆粒在溶液中分布情況的重要指標(biāo)。LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的PDI隨著ALA25℃濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢,但其數(shù)值始終在0.2～0.4之間,表明LF25 ℃與ALA25 ℃形成的納米顆粒較為均一穩(wěn)定;而LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的PDI始終在0.5～0.8之間,表明LF90 ℃與ALA25 ℃所形成的聚集體大小不均一,易發(fā)生聚集而導(dǎo)致沉淀。

2.4 光學(xué)顯微鏡觀察

通過光學(xué)顯微鏡更加直觀地觀察了當(dāng)ALA25℃濃度為0.75 mmol/L時,LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的微觀形貌。由圖4可知,在磷酸鹽緩沖溶液中,ALA25 ℃和LF90 ℃均為球形顆粒,分布較均一。在LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物溶液中,可以清晰地觀察到大量的球形聚集體,這些聚集體尺寸介于100～200 nm之間,分布較均勻;而LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物則形成清晰的網(wǎng)狀聚集體,尺寸約為2～3 μm,分布不均勻。這進一步證實了LF90 ℃-ALA25 ℃超分子結(jié)構(gòu)的形成。同時也進一步證實了所推測的可能結(jié)合機制(見濁度分析部分)。

圖4 ALA、LF和LF-ALA復(fù)合物(ALA濃度為0.75 mmol/L)的顯微鏡照片F(xiàn)ig.4 Micrograph of ALA,LF and LF-ALAcomplexes containing 0.75 mmol/L ALA

2.5 熒光光譜分析

圖5 不同ALA濃度下LF-ALA復(fù)合物和單獨ALA的熒光光譜圖(a～c)及熒光峰值變化(d)Fig.5 Fluorescence emission spectra(a～c)and peak value(d)of LF-ALA complexes and ALA alone at different ALA concentration注:(a)為LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物;(b)為LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物;(c)為單獨ALA空白。

熒光淬滅法可以用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用[31]。色氨酸(Trp)殘基通常完全或部分埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水核心中[32],通過監(jiān)測色氨酸熒光發(fā)射峰的變化(強度變化和峰位移),可以獲取色氨酸周圍微環(huán)境變化和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的信息。當(dāng)色氨酸基團位于天然蛋白質(zhì)的內(nèi)部時,色氨酸發(fā)射峰可能發(fā)生藍移;當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性展開,色氨酸發(fā)射峰可能發(fā)生紅移[33]。

圖6 LF,ALA25 ℃和LF-ALA25 ℃復(fù)合物(ALA濃度為0.75 mmol/L)的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of LF,ALA25 ℃ and LF-ALA25 ℃ complexes containing 0.75 mmol/L ALA

如圖5所示,LF25 ℃、LF90 ℃和ALA25 ℃的最大發(fā)射峰分別為335、340和329 nm。隨著ALA25 ℃濃度的增加,LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的熒光強度逐漸降低,表明:熱變性前后LF和ALA25 ℃之間均存在結(jié)合行為。同時,最大發(fā)射峰均藍移至331 nm,但并沒有與ALA25 ℃的最大發(fā)射峰重疊。這表明Trp基團位于LF的內(nèi)部,熒光強度降低說明了ALA25 ℃的添加增加了LF25 ℃和LF90 ℃分子中色氨酸的疏水性。即,LF25 ℃/LF90 ℃與ALA25 ℃之間的相互作用導(dǎo)致埋藏在LF分子內(nèi)部的Trp殘基暴露程度降低[33]。該結(jié)果與Monteiro等研究結(jié)果相似,在ALA和溶菌酶結(jié)合時,溶菌酶中Trp殘基更加難以暴露于溶液環(huán)境中[31]。

2.6 FTIR分析

FTIR(400～5000 cm-1)是分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的有力工具[34]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)變化時,其紅外光譜,尤其是酰胺A帶、酰胺I帶和酰胺II帶的峰強度或峰位置會發(fā)生改變[35]。同時,通過FTIR可以判斷LF與ALA非共價相互作用類型。圖6分別為單獨LF、ALA25 ℃,LF25 ℃-ALA25 ℃、LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的紅外光譜。

如圖6所示,ALA25 ℃在1076.2 cm-1處有較寬的特征峰,代表C-O間的伸縮振動,LF25 ℃、LF90 ℃分別在863.5、864.5 cm-1有肩峰,這與CO2H中的彎曲振動有關(guān)[35],而在LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物中,這些峰均消失,這進一步表明LF25 ℃/LF90 ℃與ALA25 ℃之間發(fā)生了相互作用。

FTIR中酰胺A帶(3310～3270 cm-1)通常與O-H間氫鍵的伸縮振動有關(guān)[19]。LF25 ℃和LF90 ℃的酰胺A帶分別在3299.6和3299.0 cm-1處,而ALA25 ℃的酰胺A帶在3299.6 cm-1處。在LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物的紅外光譜中,復(fù)合物的酰胺A帶分別藍移了0.3和1.1 cm-1。這清晰地表明:氫鍵參與了LF25 ℃/LF90 ℃與ALA25 ℃之間的相互作用。

酰胺I帶(1625和1750 cm-1)的C=O伸縮振動和酰胺II帶(1475和1575 cm-1)的C-N伸縮振動均與蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單元間的氫鍵有關(guān)[36]。由圖6可知,LF25 ℃和LF90 ℃的酰胺I帶分別在1656.0和1657.4 cm-1處,ALA25 ℃的酰胺I帶在1654.8 cm-1處。而在LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物中,酰胺I分別藍移至1659.5和1659.1 cm-1。酰胺I的藍移表明:熱處理前后,LF中的C=O基團均參與了與ALA25 ℃的相互作用。LF25 ℃和LF90 ℃的酰胺II帶分別在1540.9和1543.1 cm-1處。而在LF25 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物和LF90 ℃-ALA25 ℃復(fù)合物中,酰胺II分別紅移了1.9和3.7 cm-1。這一結(jié)果表明:LF中的C-N基團也參與了與ALA25 ℃的相互作用。

3 結(jié)論

綜上,LF-ALA25 ℃復(fù)合物受LF結(jié)構(gòu)的影響。天然LF與ALA自組裝可形成納米顆粒,粒徑最大為(35.24±0.82) nm,顆粒分布均勻,穩(wěn)定性較高;經(jīng)過熱變性,LF結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,與ALA自組裝可形成的超分子結(jié)構(gòu),粒徑最大為(4.11±0.14) μm。同時,ALA的添加降低了埋藏在LF內(nèi)部的Trp殘基的暴露程度。LF中的C=O和C-N基團均參與了與ALA25 ℃的相互作用。該研究為構(gòu)建新型雙蛋白結(jié)構(gòu)提供了理論依據(jù)。