王 越,趙文謹(jǐn),謝云飛,姚衛(wèi)蓉,郭亞輝,成玉梁,錢 和

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214000)

在夏威夷和波利尼西亞地區(qū),傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)從業(yè)者用諾麗果(MorindacitrifoliaL. Noni)治療或預(yù)防各種疾病已經(jīng)有兩千多年的歷史[1]。諾麗果實(shí)含有200多種植物化學(xué)物質(zhì),其中多酚類、蒽醌類和黃酮類等活性物質(zhì)在諾麗果的生物活性方面起著關(guān)鍵作用,但在不同品種中其含量差異顯著[2-3]。如今,諾麗果越來越多的藥用價(jià)值和保健功能被證實(shí),例如抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲、鎮(zhèn)痛、降壓、抗炎和增強(qiáng)免疫力等[4-6]。因此,諾麗果也迅速成為世界藥用植物和保健類產(chǎn)品的新寵。成熟的諾麗鮮果具有強(qiáng)烈的刺激性氣味,不適宜直接食用,所以出現(xiàn)多種多樣的諾麗果加工形式,如諾麗凍干粉、諾麗果干、諾麗發(fā)酵果汁等,其中發(fā)酵果汁逐漸成為其主要應(yīng)用形式[1,7]。

目前,諾麗果的發(fā)酵生產(chǎn)大多沿用波利尼西亞傳承下的古老方式,即將洗凈的諾麗果放在密封的發(fā)酵容器中,利用諾麗果自身所帶微生物在室溫下進(jìn)行自然發(fā)酵,靜置發(fā)酵三個(gè)月到一年甚至更長時(shí)間[2,4]。近些年也出現(xiàn)一些其他諾麗果汁發(fā)酵方式,如Wang等[8]利用不同乳酸菌發(fā)酵諾麗果,通過檢測(cè)發(fā)酵期間的理化指標(biāo)、微生物數(shù)量及抗氧化性的變化情況,發(fā)現(xiàn)最適宜發(fā)酵諾麗果的乳酸菌是植物乳桿菌和雙歧桿菌。此外,還有利用纖維素酶將諾麗果酶解后再進(jìn)行發(fā)酵[9]、酵母菌發(fā)酵[10]和加糖發(fā)酵[11]等發(fā)酵方式。由于缺少統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)的評(píng)價(jià)體系,現(xiàn)在市場(chǎng)上充斥著各式各樣、五花八門的諾麗發(fā)酵果汁產(chǎn)品,品質(zhì)良莠不齊[8]。

植物乳桿菌因其保健功能和產(chǎn)細(xì)菌素特性是工業(yè)發(fā)酵最常用的乳酸菌[8],本文在諾麗果前期自然發(fā)酵基礎(chǔ)上接種植物乳桿菌發(fā)酵劑,對(duì)諾麗果進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵研究。通過監(jiān)測(cè)和分析諾麗果強(qiáng)化發(fā)酵過程中關(guān)鍵理化指標(biāo)(pH、總酸、可溶性固形物、總糖)、有機(jī)酸、活性成分(總酚、總黃酮、蘆丁、槲皮素、東莨菪素)含量以及發(fā)酵產(chǎn)品抗氧化能力的變化規(guī)律,科學(xué)、系統(tǒng)地評(píng)價(jià)諾麗果發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì),為進(jìn)一步深入開展諾麗果發(fā)酵過程及功能成分研究建立理論基礎(chǔ),同時(shí)也為諾麗果工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供重要的工藝和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾麗果 無錫諾園生物科技有限公司;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,CICC22703)中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒 南京建成生物工程研究所;MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司;乙腈、甲醇 均為色譜純,美國Tedia公司;蘆丁(純度≥99%)、東莨菪素(純度≥99%)、三氟乙酸(光譜純)、槲皮素(生化試劑,純度≥99%) 美國Sigma試劑有限公司;氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、濃硫酸、福林酚和碳酸鈉等試劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AX224ZH/E電子天平 奧豪斯儀器有限公司;KQ-600KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SW-CJ-2D型單面垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái) 上海鼎科科學(xué)儀器有限公司;T9雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;RJ-TDL-50A低速臺(tái)式大容量離心機(jī) 無錫市瑞江分析儀器有限公司;DH4000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱 杭州賽普科學(xué)儀器有限公司;1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司;SCION SQ 456-GC氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國布魯克公司;Millipore超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 諾麗果發(fā)酵工藝設(shè)計(jì) 參考陸雨[12]的發(fā)酵方式,有所改動(dòng)。取新鮮、無破損的諾麗果,洗凈表面,晾干后立即放入密封無菌玻璃罐中。25 ℃放置7 d后,待果實(shí)完全成熟,將其裝入無菌袋中拍打、8 h/s勻質(zhì)1 min,所得諾麗果泥密封在無菌玻璃罐待用。將以上諾麗果泥均勻分為2份(每份1 kg),其中:強(qiáng)化發(fā)酵組(IF):接種植物乳桿菌(通過前期實(shí)驗(yàn)確定最佳接種量2.5%(w/w),活化至兩代);對(duì)照組(NF):自然發(fā)酵。兩組樣品均置于25 ℃[13]條件下繼續(xù)發(fā)酵30 d,總發(fā)酵時(shí)長37 d。分別于0、7、9、16、23、37 d取樣,并立即置于-80 ℃保存。工藝流程圖如下:

圖1 諾麗果發(fā)酵工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of noni fruit fermentation

1.2.2 發(fā)酵過程中pH、總酸、可溶性蛋白和總糖的測(cè)定 pH和總滴定酸度的檢測(cè)方法參考國標(biāo)《GBT 15038-2006 葡萄酒、果酒通用分析方法》。可溶性蛋白的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[13]?？偺呛康臏y(cè)定采用蒽酮比色法[14]。

1.2.3 植物乳桿菌的測(cè)定 采用《GB 4789.35-2016 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》。

1.2.4 發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的測(cè)定 用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定諾麗果汁中有機(jī)酸的含量[15],包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸和富馬酸。將諾麗果汁4000 r/min離心10 min取上清,稀釋5倍后微濾(0.45 μm)過膜,HPLC分析。采用 Ecosil C18色譜柱,流動(dòng)相為甲醇-水-H3PO4溶液(A體積比80∶15∶5;B體積比5∶90∶5),柱溫30 ℃,流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL,UV檢測(cè)(210 nm)。流動(dòng)相梯度洗脫條件如下:

表1 有機(jī)酸測(cè)定流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Gradients elution conditions of mobilephase for determination of organic acids

1.2.5 發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的測(cè)定

1.2.5.1 發(fā)酵諾麗果汁總酚含量測(cè)定 Folin-Ciocalteu比色法[16]。以沒食子酸的濃度(x)為橫坐標(biāo),波長760 nm處的吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.0047x+0.0597,決定系數(shù)R2=0.9993。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程計(jì)算樣品中總酚含量。

1.2.5.2 發(fā)酵諾麗果汁總黃銅含量測(cè)定 NaNO2-Al(NO3)3比色法[17]。以蘆丁的濃度(x)為橫坐標(biāo),波長510 nm處的吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為:y=0.0033x+0.0484,決定系數(shù)為R2=0.999。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.2.6 發(fā)酵過程中三種主要單體植物素成分含量的測(cè)定 測(cè)定發(fā)酵過程中蘆丁、槲皮素和東莨菪素的含量變化。稱取諾麗果泥2.0 g加入8.0 mL甲醇,以頻率為50 kHz,溫度為25 ℃超聲提取30 min后,得到溶液離心5 min(3000 r/min),取上清液過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析[18]。每份樣品平行測(cè)定3次。檢測(cè)條件參考羅宇展[19]的檢測(cè)方法,采用Ecosil C18色譜柱,流動(dòng)相A:1 mL/L乙腈+1 mL/L磷酸,流動(dòng)相B:100%乙腈,柱溫40 ℃,流速1 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL,在345 nm進(jìn)行檢測(cè)[20]。流動(dòng)相梯度洗脫條件如下:

表2 三種主要單體植物素測(cè)定流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 2 Gradients elution conditions of mobilephase for determination of three compounds

1.2.7 發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的測(cè)定

1.2.7.1 總抗氧化能力(T-AOC)的測(cè)定 使用總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)試劑盒(比色法)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7.2 清除二苯基苦基苯肼自由基(DPPH)能力的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[21]方法。將1 mL諾麗發(fā)酵果汁用磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)稀釋10倍混勻,作為待測(cè)液。分為以下3組:

表3 DPPH自由基清除能力測(cè)定操作表Table 3 DPPH free radical scavengingcapacity determination operation table

分別充分混勻后室溫避光反應(yīng)30 min,517 nm波長下測(cè)定吸光度值,每個(gè)試樣重復(fù)3次。DPPH自由清除率計(jì)算公式如下:

DPPH自由基清除能力(I,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中，A0、A1和A2分別為空白、樣品和對(duì)照的吸光度值。

1.2.7.3 清除羥自由基能力的檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[22]方法。將1 mL諾麗發(fā)酵果汁用磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)稀釋5倍混勻,作為待測(cè)液。分為以下3組:

表4 羥自由基清除能力的測(cè)定操作表Table 4 Hydroxyl free radical scavengingcapacity determination openation table

分別充分混勻后于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min,510 nm波長下測(cè)定吸光度值,每個(gè)試樣重復(fù)3次。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下:

OH自由基清除能力(I,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中,A0、A1和A2分別為空白、樣品和對(duì)照的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中pH、總酸、可溶性蛋白和總糖的變化

圖2 諾麗果發(fā)酵過程中pH、總酸、可溶性蛋白和總糖的變化Fig.2 Changes in the pH,total acidity,soluble protein content and total carbohydrate content during noni fermentation注:圖中字母不同表示差異顯著(P<0.05),小寫字母代表NF組,大寫字母代表IF組,圖3～圖5、圖7同。

2.2 發(fā)酵過程中有植物乳桿菌數(shù)量的變化

由圖3可知,諾麗果發(fā)酵過程中植物乳桿菌數(shù)量大體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),與Chan-Blanco等[24]得出的結(jié)論一致。其中,IF組在9 d植物乳桿菌數(shù)量迅速增加至7.80×106CFU/mL,這是由于初始發(fā)酵階段營養(yǎng)物質(zhì)充足,環(huán)境適宜,植物乳桿菌大量增殖,在16 d數(shù)量達(dá)到1.62×107CFU/mL,隨后開始下降,這是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的延長,發(fā)酵基質(zhì)酸度的升高(圖2)、營養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及微生物代謝廢物的產(chǎn)生抑制了植物乳桿菌的生長繁殖[25]。NF組植物乳桿菌數(shù)量在16 d也有明顯增加,隨后緩慢減少,在IF組植物乳桿菌數(shù)量達(dá)到峰值(16 d)時(shí),兩組植物乳桿菌數(shù)量相差兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上,此時(shí)IF組以植物乳桿菌為主要發(fā)酵微生物。

圖3 諾麗果發(fā)酵過程中植物乳桿菌的變化Fig.3 Changes in the Lactobacillus plantarumpopulations during noni fermentation

2.3 發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化

有研究表明,某些有機(jī)酸為諾麗發(fā)酵果汁提供獨(dú)特的刺激性酸味,其中辛酸和己酸為特征性有機(jī)酸[26]。為探究具體有機(jī)酸的變化情況,針對(duì)甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸和富馬酸這十種常見的有機(jī)酸進(jìn)行檢測(cè)[27-28]。其中甲酸和富馬酸在兩組發(fā)酵過程中的含量均始終低于0.01 mg/mL,未在表5中展示。從表5可以看出,經(jīng)過23 d強(qiáng)化發(fā)酵,IF組乙酸、丙酸、丁酸、己酸的含量均低于NF組,其中IF組丁酸(脂肪臭、不愉快的味道[29])含量較NF組顯著降低(P<0.05),與郝玉潔等[28]研究結(jié)果一致。在整個(gè)發(fā)酵過程中,己酸的含量最高,其中NF組30 d最高達(dá)到(16.028±0.217) mg/mL,IF組37 d最高達(dá)到(9.834±0.375) mg/mL,是諾麗果發(fā)酵果汁中的主要揮發(fā)性有機(jī)酸[30]。

2.4 發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的變化

酚類物質(zhì)的含量決定著發(fā)酵諾麗果汁的顏色、味道等感官特性[31]。如圖4A所示,在強(qiáng)化發(fā)酵過程中總酚含量先上升后下降,其中總酚含量從開始的(7.800±0.271) mg/mL在發(fā)酵23 d上升到(15.538±1.213) mg/mL,后下降到(9.157±0.174) mg/mL。這主要是因?yàn)殡S著諾麗果軟化成熟,汁液滲出,果實(shí)大部分浸漬到發(fā)酵液中,有利于果肉中的多酚類化合物溶出。同時(shí)隨著發(fā)酵過程中單體酚化合物的生物合成,多酚含量也會(huì)增加,隨后總酚含量開始顯著下降(P<0.05)。

表5 諾麗果發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化Table 5 Changes in the organic acids during noni fermentation

酚類物質(zhì)在諾麗鮮果中多以結(jié)合態(tài)的形式存在,而在發(fā)酵過程中,其在微生物及各種酶的多重作用下,將大分子轉(zhuǎn)化成小分子并釋放進(jìn)入諾麗發(fā)酵果汁中[32]。酚類物質(zhì)的氧化與溶出也是同時(shí)進(jìn)行的,到了發(fā)酵后期,溶出的速率降低,而氧化過程仍在繼續(xù),導(dǎo)致酚類呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢(shì)[33]。

總黃酮含量的變化趨勢(shì)(圖4B)與總酚含量的變化相似,在IF組中其含量也是在23 d達(dá)到0.542 mg/mL,略高于晏永球[13]檢測(cè)到諾麗果自然發(fā)酵過程的總黃酮含量峰值0.49 mg/mL。但是在后續(xù)的發(fā)酵過程中總黃酮含量下降不明顯,NF組仍保持整體呈上升趨勢(shì)。這可能是由于隨著果肉浸漬,黃酮類化合物從果中滲出導(dǎo)致總黃酮含量上升。

圖4 諾麗果發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的變化Fig.4 Changes in total polyphenol contentsand total flavonoids contents during noni fermentation

2.5 發(fā)酵過程中主要單體植物素成分含量的變化

蘆丁、槲皮素和東莨菪素是諾麗果中被關(guān)注較多的功能性植物素[34]。現(xiàn)代研究認(rèn)為蘆丁具有降低毛細(xì)血管的異常通透性和脆性的作用,是心血管疾病制劑的主要成分[35];槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗菌、抗病毒等作用[36];東莨菪素是香豆素類衍生物,具有良好的抗氧化和抗真菌作用[18],有研究表明這三種植物素的含量與品種密切相關(guān),不同品種的諾麗果發(fā)酵液含量差異明顯[34]。由圖5可知,新鮮諾麗果中蘆丁的含量為(112.123±4.903) μg/g,經(jīng)37 d發(fā)酵IF組降低到(47.434±3.574) μg/g,NF組降低到(52.826±2.873) μg/g,這可能是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行蘆丁轉(zhuǎn)化為其他小分子物質(zhì)[37];槲皮素的含量從(2.462±4.903) μg/g上升到(15.534±3.574) μg/g,雖然低于NF組(19.009±2.873) μg/g,但與新鮮諾麗果相比,仍顯著上升(P<0.05)。經(jīng)過相關(guān)性分析,發(fā)酵過程中蘆丁含量與槲皮素含量呈極顯著相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.99),由圖6可知,蘆丁和槲皮素的結(jié)構(gòu)僅差一個(gè)側(cè)鏈上的鼠李糖基,槲皮素含量的增加可能是因?yàn)樘J丁在發(fā)酵過程中水解,這與目前關(guān)于利用微生物轉(zhuǎn)化制備槲皮素的研究情況相符[38]。東莨菪素的含量在發(fā)酵過程中整體呈下降趨勢(shì),在發(fā)酵23 d時(shí),IF組東莨菪素的含量更高,經(jīng)分析IF組東莨菪素含量與槲皮素含量顯著相關(guān)(r=0.977),NF組東莨菪素含量與槲皮素(r=0.975)和蘆丁(r=0.974)含量均顯著相關(guān)。

圖5 諾麗果發(fā)酵過程中主要單體植物素成分含量的變化Fig.5 Changes in the content of major monomerphytochemicals during noni fermentation

圖6 主要單體植物素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 Structural formula of major monomer phytochemicals

2.6 發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化

如圖7所示發(fā)酵過程中的總抗氧化能力、DPPH自由基清除率和羥自由基清除率均大體呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)。強(qiáng)化發(fā)酵過程中,總抗氧化能力、對(duì)DPPH自由基、羥自由基的清除率均在23 d達(dá)到最高,其中總抗氧化能力由初始的(1.23±0.08) mmol/L達(dá)到(1.82±0.13) mmol/L,DPPH自由基清除率由61.69%±1.20%最高達(dá)到84.76%±3.43%,羥自由基清除率由79.12%±2.02%最高達(dá)到94.41%±1.07%,較諾麗鮮果汁均有顯著提高(P<0.05),且抗氧化能力最高值均高于NF組。這可能與諾麗果發(fā)酵過程中活性物質(zhì)的變化情況與乳酸菌代謝產(chǎn)物作用有關(guān)[23,39]。綜上,諾麗果經(jīng)23 d強(qiáng)化發(fā)酵,果汁的抗氧化能力有了明顯改善。

圖7 諾麗果發(fā)酵過程中體外抗氧化能力的變化Fig.7 Changes in antioxidant activity during noni fermentation

2.7 發(fā)酵過程中抗氧化活性與總酚、總黃酮及三種植物素含量的相關(guān)性分析

諾麗果強(qiáng)化發(fā)酵23 d時(shí),總酚、總黃酮含量及體外抗氧化能力最高,因此選擇此時(shí)作為強(qiáng)化發(fā)酵的發(fā)酵終點(diǎn)。由表6可知,在NF組中,對(duì)DPPH自由基的清除能力與其蘆丁含量呈顯著相關(guān)(P<0.05),與總黃酮含量呈極顯著相關(guān)(P<0.01);在IF組中,對(duì)DPPH自由基的清除能力與其所含總酚和蘆丁含量呈顯著相關(guān)(P<0.05),與總黃酮呈極顯著相關(guān)(P<0.01)。綜合看來,發(fā)酵過程中NF、IF組的總抗氧化能力和羥自由基清除率與總酚、總黃酮及三種植物素含量均無顯著相關(guān)性,NF與IF組總抗氧化能力的差距可能是其他活性物質(zhì)或植物乳桿菌代謝產(chǎn)物作用的結(jié)果;DPPH自由基清除率與總黃酮含量相關(guān)極顯著(P<0.01),與蘆丁含量顯著相關(guān)(P<0.05),由于強(qiáng)化發(fā)酵23 d時(shí)總黃酮含量更高,得到的果汁對(duì)DPPH自由基的清除能力更強(qiáng),此外,由圖5(A)可知蘆丁的含量隨發(fā)酵時(shí)間延長逐漸減少,因此為了得到清除DPPH自由基能力強(qiáng)的諾麗發(fā)酵果汁,不宜發(fā)酵過長時(shí)間。綜上,通過23 d強(qiáng)化發(fā)酵可以得到抗氧化能力更高的諾麗果汁。

表6 諾麗果發(fā)酵過程中抗氧化活性與總酚、總黃酮及主要單體植物素含量變化間的相關(guān)性Table 6 Correlation between antioxidant activity and thecontent of total phenols,total flavonoids and majormonomer phytochemicals during noni fermentation

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過自然發(fā)酵與強(qiáng)化發(fā)酵諾麗果的對(duì)比,研究諾麗果汁發(fā)酵過程中關(guān)鍵理化性質(zhì)、有機(jī)酸、活性成分以及體外抗氧化活性等的變化規(guī)律,結(jié)果表明通過23 d強(qiáng)化發(fā)酵的諾麗果汁總酚、總黃酮、槲皮素含量均有顯著增加(P<0.05),給諾麗果汁帶來強(qiáng)烈刺激性酸味的丁酸含量顯著降低(P<0.05),從而減輕了果汁的強(qiáng)烈刺激性。與新鮮諾麗果汁相比,經(jīng)23 d強(qiáng)化發(fā)酵,果汁的抗氧化能力也有顯著提升(P<0.05)。本文以諾麗果為發(fā)酵基質(zhì),首次采用植物乳桿菌進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵,得到了活性成分較高、風(fēng)味較為柔和且抗氧化能力強(qiáng)的諾麗果發(fā)酵汁。