李 婷,向燦輝,王文君

(遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū),生物工程系,廣東珠海 519041)

肥胖和超重是指體內(nèi)脂肪異?；蜻^多的堆積[1],據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計(jì)顯示[2],自1975年來,肥胖人數(shù)已增長近三倍,超過6.5億人肥胖,成年人中有39%超重,其中13%肥胖。肥胖不僅會影響生活質(zhì)量[3],還是許多疾病的主要危險(xiǎn)因素[4],包括糖尿病[5]、心血管疾病[6-7]和癌癥[8-9],如何有效預(yù)防和治療肥胖是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。胰脂肪酶(Pancreatic Lipase,PL)[10]是消化食物脂肪的主要消化酶,可以將膳食中的脂肪水解為單酰甘油和脂肪酸,單酰甘油和脂肪酸再被機(jī)體吸收合成脂肪,造成脂肪堆積,抑制PL活性可減少機(jī)體對膳食中脂肪的水解和吸收,從而預(yù)防或治療肥胖。奧利司他是唯一臨床批準(zhǔn)上市的胰脂肪酶抑制劑藥物,來源于微生物,除具有令人不愉快的胃腸道反應(yīng)(油性糞便、油性斑點(diǎn)及胃脹氣等[11])外,FDA在2015年的報(bào)告中指出長期服用奧利司他會增加肝損傷、胰腺炎、膽結(jié)石和腎結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)[12],因此,尋找更安全有效的抗肥胖藥物具有十分重要的意義。

植物來源的天然化合物是高效低毒藥物的一個重要來源,研究顯示植物中的黃酮類化合物可抑制PL活性[13]。Jo等[14]從拓木中分離出14種黃酮類化合物,有6種黃酮類化合物對PL抑制率大于50%;Zeng等[15]研究顯示陳皮提取物對PL有抑制作用,采集時間不同,黃酮類化合物含量也有所區(qū)別,且陳皮提取物對PL的抑制作用與總黃酮含量呈正相關(guān)關(guān)系。水翁花是“清熱涼茶”中成藥主要成分之一,主要來源于廣東、廣西等省,民間常將其熬煮做涼茶。2′,4′-二羥基-6′-甲氧基-3′,5′-二甲基查耳酮(2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′-dimethylchalcone,DMC)是中藥材水翁花蕾中黃酮類的主要成分之一[16],Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)水翁花不同極性提取部位及提取物DMC對PL有抑制作用,但未深入研究其抑制機(jī)理。因此,本文進(jìn)一步研究DMC對PL的抑制作用,并探索DMC與PL的相互作用及作用機(jī)理,為開發(fā)DMC作為PL抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DMC 本課題組從水翁花蕾中分離得到[18],經(jīng)超高效液相色譜儀檢測純度為98.56%;奧利司他和4-硝基苯丁酸酯(4-nitrophenyl butyrate,pNPB) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;胰脂肪酶(來自豬胰,30000 U/g) 上海源葉生物科技有限公司;對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP) 上海麥克林生化科技有限公司;二甲基亞砜 天津市大茂化學(xué)試劑廠;其他化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

F-4600熒光分光光度計(jì) 日本日立公司;Cary 8454 UV-Vis 安捷倫科技有限公司;JB-3恒溫定時攪拌器 上海雷磁儀器廠;PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;SepctraMan M5酶標(biāo)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司;XS205 DualRange電子天平 梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DMC對胰脂肪酶的抑制作用

1.2.1.1 溶液配制 Tris緩沖液(0.25 mol/L,含0.25 mol/L NaCl和0.7 mmol/L CaCl2,pH=7.4):稱取7.57 g Tris,3.65 g NaCl和19.4 mg CaCl2加適量水溶解,用鹽酸調(diào)pH至7.4,室溫冷卻,轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,加水定容至刻度,搖勻,4 ℃保存。

PL工作液:取50 mg PL加10 mL Tris緩沖液配制得5 mg/mL酶溶液,振搖15 min,18 ℃下4000 r/min離心10 min,分離上清,上清即為PL工作液,置于冰盒中待用,現(xiàn)配現(xiàn)用。

底物pNPB溶液(10 mmol/L):量取17.5 μL pNPB用乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶。

DMC用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,使DMC在體系中最終濃度為2、8、16、32、64 μmol/L,奧利司他作為陽性對照。

1.2.1.2 抑制率測定 采用對硝基苯酚法測定抑制率[19],在48孔板中加入875 μL Tris緩沖液、100 μL PL工作液、20 μL DMC(DMC終濃度為2、8、16、32、64 μmol/L),37 ℃中孵育5 min,然后加入5 μL pNPB溶液,2.5 min后使用酶標(biāo)儀測定405 nm處的OD值。平行三次。奧利司他(奧利司他終濃度為0.2、1、4、8 μmol/L)代替DMC作為陽性對照,DMSO代替DMC作為不加抑制劑組。運(yùn)用SPSS 20計(jì)算IC50。

抑制率(%)=(AE-AT)/AE×100,式中AE為不加抑制劑組的OD值;AT為加抑制劑組的OD值。

1.2.2 DMC抑制胰脂肪酶的酶動力學(xué)特征 精密稱取139.28 mg pNP,用DMSO溶解并定容至10 mL得儲備液,從儲備液中取適量用DMSO稀釋得0.05、0.5、1、1.5、2 mmol/L pNP的DMSO溶液,分別取20 μL pNP的DMSO溶液加975 μL Tris和5 μL乙腈得 0.001、0.01、0.02、0.03、0.04 mmol/L pNP的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,用酶標(biāo)儀測定其405 nm處的吸光度,以DMSO替代pNP扣除空白,以pNP的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度(c)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程為A=9.008c+0.0009,決定系數(shù)R2=0.9999。

對硝基苯酚法測酶活的原理為底物pNPB在PL的催化下加速分解為pNP。在48孔板中加入875 μL Tris緩沖液、100 μL PL工作液、20 μL 不同濃度的DMC溶液(DMC終濃度為0、10、50 μmol/L),37 ℃中孵育5 min,然后分別加入5 μL 不同濃度的pNPB溶液(pNPB終濃度為0.05、0.1、0.2、0.25 mmol/L),每隔0.5 min測一次OD值,根據(jù)pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算pNP生成量,以時間為橫坐標(biāo),pNP生成量為縱坐標(biāo)作圖,斜率即為不同濃度pNPB在PL作用下的反應(yīng)速率。以底物濃度[S]的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率(V)的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,根據(jù)對照組(不加DMC)和實(shí)驗(yàn)組(加DMC)直線相交位置推斷DMC對PL的抑制類型。

1.2.3 DMC與PL相互作用的研究

1.2.3.1 DMC對PL熒光光譜的影響 稱取5 mg PL溶解在適量Tris中,振搖15 min,18 ℃下4000 r/min離心5 min,取上清定容至100 mL得1.25×10-6mol/L的PL溶液,取25 mL PL于燒杯中,逐次加入50 μL濃度為1.5 mmol/L的DMC溶液,共滴加7次,DMC終濃度為0、3、6、9、12、15、18、21 μmol/L。以λex=278 nm為激發(fā)波長,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5、10 nm,掃描PL以及每滴加一次DMC后PL溶液的熒光光譜,每次測量后將溶液合并至原溶液。

1.2.3.2 DMC對PL的熒光猝滅特性 溶液濃度及配制方法同1.2.3.1,PL濃度為1.25×10-6mol/L,DMC終濃度為3、6、9、12、15、18、21 μmol/L,分別于298和310 K測定DMC對PL熒光強(qiáng)度的影響,根據(jù)Stern-Volmer方程[20]判斷猝滅類型:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

式(1)

式中,F0為PL熒光強(qiáng)度,F為加入DMC后PL的熒光強(qiáng)度,KSV為猝滅常數(shù),Kq為雙分子猝滅常數(shù),τ0為沒有猝滅劑時熒光分子的平均壽命,大約為1.59 ns[21],[Q]為抑制劑的濃度。動態(tài)猝滅時猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生碰撞導(dǎo)致熒光強(qiáng)度減弱,溫度升高,碰撞加劇,進(jìn)而擴(kuò)散系數(shù)增大,KSV增大;靜態(tài)猝滅時猝滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時生成不發(fā)光的配合物,溫度升高使配合物穩(wěn)定性下降,猝滅常數(shù)減小。因此,根據(jù)不同溫度的KSV的變化判斷DMC對PL的猝滅類型。

為進(jìn)一步確定猝滅類型,測定1.25×10-5mol/L PL溶液、1.25×10-5mol/L的DMC溶液的紫外吸收光譜及PL與DMC等摩爾混合溶液的紫外吸收光譜。由于動態(tài)猝滅不改變基態(tài)物質(zhì),只對熒光分子的激發(fā)態(tài)產(chǎn)生影響,因此其吸收光譜并不發(fā)生改變;而靜態(tài)猝滅中,猝滅劑和熒光物質(zhì)會形成配合物,從而引起熒光物質(zhì)的吸收光譜發(fā)生改變[22],因此,根據(jù)DMC對PL紫外吸收光譜的影響進(jìn)一步確定DMC對PL的猝滅類型。

1.2.3.3 DMC與PL的相互作用類型 溶液濃度及配制方法同1.2.3.1,PL濃度為1.25×10-6mol/L,DMC終濃度為3、6、9、12、15、18、21 μmol/L,分別于298和310 K測定DMC對PL熒光強(qiáng)度的影響,根據(jù)熱力學(xué)公式可計(jì)算出不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔG、ΔS[23]:

ΔG=-RTlnK

式(2)

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

式(3)

ΔS=(ΔH-ΔG)/T

式(4)

式中R為理想氣體常數(shù)。根據(jù)ΔH、ΔS、ΔG可以判斷DMC與PL的作用力類型,當(dāng)ΔH>0且ΔS>0時,作用力為疏水作用力;當(dāng)ΔH<0且ΔS<0時,作用力為氫鍵和范德華力;當(dāng)ΔH<0且ΔS>0時,作用力為靜電作用力;ΔG<0,表明相互作用是自發(fā)進(jìn)行的。

1.2.3.4 DMC對PL構(gòu)象的影響 PL分子中因含酪氨酸及色氨酸等殘基而具有較強(qiáng)的熒光,熒光光譜測定的是氨基酸殘基疊加在一起的熒光強(qiáng)度,而同步熒光[24]可以測定特定氨基酸殘基的熒光特征峰從而知道DMC對PL中氨基酸構(gòu)象及其所處環(huán)境的影響情況。當(dāng)Δλ=15 nm時,PL的同步熒光光譜顯示的是酪氨酸殘基的特征熒光光譜,當(dāng)Δλ=60 nm時,PL的同步熒光光譜顯示的為色氨酸殘基的特征熒光光譜,根據(jù)DMC對PL同步熒光光譜的最大發(fā)射波長變化判斷DMC對PL構(gòu)象的影響情況。溶液濃度及配制方法同1.2.3.1,PL濃度為1.25×10-6mol/L,DMC終濃度為0、3、6、9、12、15、18、21 μmol/L,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5、10 nm,在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm下測定PL以及每滴加一次DMC后PL溶液的同步熒光光譜。

三維熒光是另一類近幾年新興的常用的熒光分析技術(shù),可以為蛋白大分子構(gòu)象提供更詳細(xì)的信息[25],因此,為了進(jìn)一步確定DMC對PL構(gòu)象的影響,測定DMC對PL三維熒光光譜的影響。設(shè)置激發(fā)波長為240～500 nm,發(fā)射波長為240～500 nm,波長間隔5 nm,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為5、10 nm,測定1.25×10-6mol/L PL及滴加12 μmol/L DMC的PL溶液的三維熒光光譜。

1.2.4 分子對接 MOE是由加拿大CCG公司開發(fā)的分子模擬及藥物設(shè)計(jì)綜合軟件,實(shí)驗(yàn)采用MOE 2019軟件進(jìn)行分子對接。選擇DMC作為藥物配體分子,結(jié)構(gòu)在MOE軟件繪制,保存為.moe格式;選擇豬胰脂肪酶(PDI:1ETH)[26]為蛋白受體分子,由蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)提供,經(jīng)去水,加氫,能量最優(yōu)等處理,采用MOE-Dock程序?qū)烧哌M(jìn)行對接,模擬分子間的相互作用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果用平均值M±標(biāo)準(zhǔn)差SD表示。利用SPSS 22.0軟件計(jì)算IC50。利用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DMC對PL的抑制作用及酶動力學(xué)研究

2.1.1 DMC對PL的抑制作用結(jié)果 由圖1可知,DMC對PL有抑制作用,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(2～64 μmol/L),DMC濃度越高,對PL抑制作用越強(qiáng),最大抑制率為54.7%,IC50為50.01±3.56 μmol/L,陽性藥物奧利司他IC50為2.65±0.10 μmol/L。

圖1 DMC對PL活性的影響Fig.1 Effects of DMC on panreatic lipase activity

2.1.2 抑制動力學(xué)結(jié)果 通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖直線的相交位置判斷抑制類型,直線交于縱軸為競爭型抑制,直線交于橫軸為非競爭型抑制,直線交于象限內(nèi)為混合型抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2,直線交于縱軸,表明DMC對PL的抑制類型屬于競爭型抑制,DMC與底物競爭與PL活性中心結(jié)合從而抑制PL活性,DMC濃度增大,PL與底物的親和程度下降,米氏常數(shù)(Km)增大,分別為0.0671、0.0785、0.1089 mol/L,最大反應(yīng)速率(Vmax)不變,為0.0106 mmol/min。

2.2 DMC與PL相互作用的研究

2.2.1 DMC對PL熒光光譜的影響 如圖3所示,DMC的加入使PL熒光強(qiáng)度降低,熒光強(qiáng)度隨DMC濃度增加呈現(xiàn)有規(guī)律下降,表明DMC與PL發(fā)生相互作用,DMC能使PL發(fā)生熒光猝滅。

表1 DMC對胰脂肪酶熒光猝滅Stern-Volmer方程和猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer equation and constant of fluorescence disappearance of DMC on PL

圖2 DMC的雙倒數(shù)Lineweaver-Burk圖Fig.2 Double reciprocal Lineweaver-Burk plot of DMC

圖3 DMC對PL熒光光譜的影響Fig.3 Effect of DMC on PL’s fluorescence spectra注:cPL=1.25×10-6mol/L;a→h表示DMC含量為0、3、6、9、12、15、18、21×10-6 mol/L。

2.2.2 DMC對PL的熒光猝滅特性 熒光猝滅分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅,可通過不同溫度下的KSV來判斷猝滅類型,結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,溫度升高,KSV增大,表明DMC對PL的猝滅屬于動態(tài)猝滅。

圖4 DMC對PL紫外吸收光譜的影響Fig.4 Effect of DMC on UV absorption of PL注:a:DMC與PL 1∶1混合(cDMC=cPL=1.25×10-5 mol/L);b:cPL=1.25×10-5 mol/L。

為進(jìn)一步確定猝滅類型為動態(tài)猝滅,測定了PL及DMC與PL等摩爾混合的紫外吸收光譜,結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示,PL與DMC等摩爾混合后的吸收光譜與PL吸收光譜基本重合,DMC的加入不會改變PL的紫外光譜,進(jìn)一步說明DMC對PL的猝滅屬于動態(tài)猝滅。

2.2.3 DMC與PL的相互作用類型 小分子猝滅劑與蛋白質(zhì)大分子相互作用力有疏水作用、氫鍵、范德華力、靜電作用力等,根據(jù)熱力學(xué)公式可計(jì)算出不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)ΔH、ΔG、ΔS,結(jié)果如表2。結(jié)果顯示ΔH<0,ΔS<0,表明DMC與PL的相互作用力主要為氫鍵和范德華力,ΔG<0,表明兩者之間的相互作用是自發(fā)進(jìn)行的。

表2 不同溫度下DMC與PL相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters ofDMC and PL at different temperatures

2.2.4 DMC對PL構(gòu)象的影響 同步熒光可以測定特定氨基酸殘基的熒光特征峰從而知道DMC對PL中氨基酸構(gòu)象及其所處環(huán)境的影響情況,結(jié)果如圖5所示。圖5(a)和5(b)分別是Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時DMC的加入對PL影響的同步熒光圖,由圖5可知,DMC的加入僅使熒光強(qiáng)度降低,最大發(fā)射波長基本無變化,表明DMC未使PL構(gòu)象發(fā)生改變。

圖5 DMC對PL同步熒光光譜的影響Fig.5 Effect of DMC on synchronous fluorescence spectra of PL注:(a)Δλ=15 nm;(b)Δλ=60 nm;cDMC(a→h):0、3、6、9、12、15、18、21×10-6 mol/L;cPL=1.25×10-6 mol/L。

表3 PL、PL-DMC體系的三維熒光光譜特征參數(shù)Table 3 Three-dimensional fluorescence spectra of DMC and PL-DMC

為了進(jìn)一步確定DMC 對PL構(gòu)象的影響,掃描了加入DMC對PL三維熒光光譜的影響。結(jié)果如圖6所示,峰p1為PL的色氨酸和酪氨酸殘基的峰,峰p2是瑞利散射峰(λex=λem),峰p3是二級散射峰(λex=2λem),DMC的加入沒有使PL的三維熒光光譜圖增加或減少峰,相關(guān)參數(shù)見表3,峰p1僅熒光強(qiáng)度下降,而對應(yīng)的激發(fā)波長和發(fā)射波長均無變化,進(jìn)一步表明DMC不會引起PL構(gòu)象發(fā)生變化。

圖6 PL、PL-DMC體系的三維熒光等高線光譜圖Fig.6 Three-dimensional fluorescencespectra of PL and PL-DMC注:cPL=1.25×10-6 mol/L,cDMC=1.2×10-5 mol/L。

2.3 分子對接

分子對接結(jié)果如圖7,圖7(a)為對接3D圖,綠色表示DMC分子,標(biāo)紅的為Ser 153,圖7(b)為對接2D圖,綜合打分-6.3747。PL的活性中心由組氨酸(His)和絲氨酸(Ser)組成,與另一種氨基酸殘基(Asp)一起構(gòu)成PL催化中心三元組[27]。由圖7可知,DMC與PL有相互作用,與催化位點(diǎn)Ser 153以氫鍵形式結(jié)合,因此可以推斷,DMC可以與底物競爭結(jié)合酶的活性中心而抑制PL活性,從而抑制了底物的降解,有利于預(yù)防和治療肥胖,屬于PL的競爭性抑制劑。上述結(jié)果與酶抑制實(shí)驗(yàn)和熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果均相符。

圖7 DMC與PL分子對接圖Fig.7 Molecular docking model of DMC and PL

3 結(jié)論

采用水翁花蕾中分離得到的黃酮單體DMC,研究了其對PL的抑制作用,IC50為50.01±3.56 μmol/L,酶動力學(xué)表明DMC是PL的競爭型抑制劑;光譜實(shí)驗(yàn)表明DMC通過與PL激發(fā)態(tài)發(fā)生碰撞的動態(tài)猝滅方式使PL發(fā)生熒光猝滅,二者作用力為氫鍵和范德華力且反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行,DMC不會改變PL構(gòu)象。分子對接進(jìn)一步闡述DMC通過與PL的催化位點(diǎn)Ser 153氫鍵結(jié)合而抑制PL活性。此研究可為DMC作為PL抑制劑開發(fā)提供相關(guān)理論參考。