,,,,*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點實驗室,福建福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所,福建福州 350002)

α-法呢烯(C15H24)是最簡單的非環(huán)狀倍半萜類次生代謝物質(zhì)[1](圖1)。作為植物中具揮發(fā)性的花果香成分[2],在誘導(dǎo)昆蟲產(chǎn)卵[3]、植物防御[4]、生長調(diào)控[5]等方面具有重要作用。α-法呢烯合成酶(AFS)屬于2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑(MEP途徑)和甲羥戊酸途徑(MVA途徑)的下游限速酶[6],直接參與了α-法呢烯的后期合成?，F(xiàn)代科學(xué)對于α-法呢烯的研究與應(yīng)用已經(jīng)深入食品工業(yè)、醫(yī)療工業(yè)等領(lǐng)域[7]。

圖1 α-法呢烯化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of α-farnesene

茶樹鮮葉經(jīng)萎凋、做青、殺青等加工工藝,促使香氣物質(zhì)前體發(fā)生一系列水解和轉(zhuǎn)化[8],從而形成了烏龍茶天然花果香的品質(zhì)特點。α-法呢烯是烏龍茶成茶重要賦香物質(zhì)之一,在烏龍茶中呈花果香[9]。與果樹[10-11]、煙草[12]等植物中α-法呢烯代謝不同,茶樹葉片在遭受脅迫時會釋放α-法呢烯作為響應(yīng)。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn),蟲咬等生物脅迫促使茶樹釋放茉莉酸,誘導(dǎo)CsAFS基因上調(diào)表達(dá),促使α-法呢烯的合成釋放;同時,α-法呢烯可充當(dāng)信號因子傳遞給其它未受生物脅迫的茶樹,有助于研究茶樹抵抗環(huán)境脅迫及茶樹植物應(yīng)激激素的釋放。在茶葉采摘離體后,茶葉加工過程中所施加的外源脅迫因子,如失水可明顯改變做青葉的香氣組成模式,α-法呢烯等物質(zhì)含量逐漸增多[14];機(jī)械力反復(fù)作用下的搖青葉形成豐富的香氣物質(zhì),有助于形成烏龍茶的花果香[15-16];光照[17-18]、溫度[19-20]激活了葉片中的MEP和MVA途徑。香氣是烏龍茶品質(zhì)的核心因素之一[21]。前人的研究中,多是研究烏龍茶的香氣組成及比較不同品種烏龍茶的賦香物質(zhì),如黃福平等[22]認(rèn)為與肉桂茶品質(zhì)密切相關(guān)的特征性香氣組分主要有橙花叔醇、己酸己烯酯、α-法呢烯、芳樟醇等;陳榮冰等[23]對比黃旦與瑞香的香氣差異,認(rèn)為兩種烏龍茶各自的品種香主要是因為橙花叔醇、香葉醇、α-法呢烯等物質(zhì)的含量存在差異。亦有研究比較不同工藝處理下的同一品種烏龍茶的香氣組分,如陳林等[24]通過調(diào)控鐵觀音制作工藝,調(diào)控烏龍茶做青與烘干工序,做成不同風(fēng)味的鐵觀音,利用鐵觀音新茶與陳茶香氣組成的化學(xué)模式的差異,提出橙花叔醇、α-法呢烯、吲哚等物質(zhì)可以作為區(qū)分鐵觀音新茶和陳茶的主要特征香氣成分。然而,結(jié)合茶樹次生代謝途徑,就某單一的特征香氣形成和變化的研究,卻不多見。

萜類化合物是植物的次生代謝物[25],伴隨著茶樹生長與茶葉采摘加工過程中的生物脅迫誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子會影響次生代謝物的產(chǎn)生[26]。陳壽松等[27]認(rèn)為,烏龍茶中的倍半萜類,如橙花叔醇、α-法呢烯呈現(xiàn)宜人的花果香,其香味閾值對烏龍茶的風(fēng)味形成貢獻(xiàn)很大。本研究以烏龍茶鮮葉、萎凋葉、做青過程葉為研究試材,通過檢測樣品中α-法呢烯的相對含量,計算基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出α-法呢烯合成酶關(guān)鍵基因并驗證其相對表達(dá)水平,分析研究烏龍茶加工過程中α-法呢烯合成的分子機(jī)制,以期為今后研究烏龍茶花果香的形成提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃旦品種春季1芽3葉 無病蟲害，采摘于福建農(nóng)林大學(xué)茶學(xué)教學(xué)科研實踐基地茶樹資源圃;RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;PremeScriPtTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTM大連寶生物工程有限公司。

6CYQT-60型搖青機(jī)、LGJ-25C 型真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)生物制藥有限公司;7890B氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;MPS 多功能自動進(jìn)樣系統(tǒng) 德國格斯特爾公司;Pegasus HT 飛行時間質(zhì)譜 美國力可公司;Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司;K5500 超微量分光光度計 北京凱奧公司;LightCycler 480實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀 美國羅氏公司;萃取針PDMS/DVB9(23 Ga,Plain,65 μm) 美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗處理及分組 樣品于2018年10月1日下午3～5時采集,采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽三葉,要求老嫩程度均一且無病蟲害的黃旦鮮葉(F),鮮葉采摘后進(jìn)行30 min萎凋,獲得萎凋葉(SW)。萎凋后的做青加工先后有三次,搖青機(jī)速度控制在25 r/min,搖青時間控制在5 min,每次搖青后進(jìn)行60 min的晾青。分別在三次搖青階段結(jié)束后采集500 g樣品,標(biāo)注為T1、T2、T3,作為實驗組(EG)。在采集實驗組樣品的同時,分別取同一時間段的未經(jīng)做青工序的萎凋葉樣品各500 g,標(biāo)注為CK1、CK2、CK3,作為對照組。以上每個取樣設(shè)3個重復(fù)。所有樣品用錫箔紙包好后,快速放入液氮后取出,于-70 ℃冷藏。

1.2.2 香氣檢測 稱取2.0 g茶葉粉末于20 mL頂空瓶,蓋好后利用頂空固相微萃取法(HS-SPME)提取揮發(fā)性物質(zhì),并用氣相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(GC-TOF-MS)進(jìn)行檢測。SPME:萃取針PDMS/DVB9設(shè)定孵育溫度為80 ℃,孵育時間為31 min,萃取時間為60 min,解析時間為3.5 min。色譜條件:色譜柱Rxi?-5silMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。進(jìn)樣口溫度控制在250 ℃,傳輸線溫度設(shè)定為275 ℃,以氦氣為載氣,設(shè)置氦氣流速為1 mL/min;程序升溫過程為50 ℃保持5 min,以3 ℃/min的速率升至210 ℃并保持3 min,此后再以15 ℃/min的速率升至230 ℃;不分流進(jìn)樣品。質(zhì)譜條件:溶劑延遲時間設(shè)定為300 s,掃描范圍控制在30～500 amu,采集速率為10 Spec/s;檢測器電壓為1530 V,EI電離能量為70 eV,離子源溫度為250 ℃。

測得揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)由儀器自帶軟件進(jìn)行分析處理,與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)局化學(xué)(The National Institute of Standards and Technology,NIST)數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜進(jìn)行比較,查對有關(guān)質(zhì)譜資料,對基峰、質(zhì)核比和相對峰度等方面進(jìn)行分析,結(jié)合保留時間和質(zhì)譜分別對各峰加以確認(rèn),從中鑒定出了α-法呢烯組分,將峰面積>1%的色譜峰作為有效觀測值,以峰面積歸一化法確定α-法呢烯組分在各樣品中的百分含量[28-30]。

表1 qRT-PCR特異性引物Table 1 The specific primers for qRT-PCR

1.2.3 茶樹全基因組的來源 基于茶樹全基因組數(shù)據(jù)庫Tea Plant Information Archive(TPIA,http://tpia. teaplant.org/),在KEGG代謝通路中的倍半萜及三萜生物合成(#00909)中獲得11條α-法呢烯合成相關(guān)基因(圖2)。

圖2 KEGG代謝通路中編碼α-法呢烯合成酶基因家族成員Fig.2 KEGG pathway of CsAFS gene family members

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建 對篩選獲得的CsAFS基因家族成員的核酸序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行對比,獲得其他植物物種的同源序列,使用Mega7.0以鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹另存為NWK文檔,利用iTOL網(wǎng)站(http://itol.embl.de/)對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行可視化處理。

1.2.5 總RNA的提取與cDNA的合成 參照RNAprep Pure Plant Kit說明以離心柱法抽提1.2.1中鮮葉、萎凋葉及實驗組、對照組的茶樹葉片加工過程中的總RNA,利用超微量核酸分析儀檢測其濃度和純度,1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,將獲得的cDNA文庫置于-20 ℃條件下貯藏備用。

1.2.6 qRT-PCR檢測 采用SYBR@Premix Ex TaqTM試劑盒對黃旦葉片的CsAFS7基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測。利用DNAman設(shè)計目的基因的特異性引物如表1所示。以CsGADPH為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系20.0 μL:SYBR Green Master Mix 10.0 μL,正、反向引物各0.8 μL,滅菌水7.4 μL,cDNA模板1.0 μL。擴(kuò)增程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s進(jìn)行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt分別計算出相關(guān)基因的相對表達(dá)量[31]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 6.0 和 SPSS 20對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及制圖,分別利用ANOVA并圖基(Tukey)法和獨立樣本t檢驗衡量實驗組與對照組中α-法呢烯含量及CsAFS相關(guān)基因表達(dá)水平的組內(nèi)差異和組間差異的顯著性;利用皮爾遜相關(guān)系數(shù)評估α-法呢烯含量CsAFS基因的表達(dá)水平的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏龍茶加工過程α-法呢烯的鑒定及其動態(tài)變化規(guī)律

通過頂空固相微萃取法(HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(GC-TOF-MS)技術(shù),進(jìn)行烏龍茶香氣檢測,各樣品的總離子流圖如圖3所示?；贜IST數(shù)據(jù)譜庫鑒定出α-法呢烯組分的離子峰(R.T.=2157.7),如圖4所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn),從鮮葉(F)到第三次搖青葉(T3)α-法呢烯的組分相對含量整體呈現(xiàn)上升趨勢,在T3時含量達(dá)到最高值0.9485%。在實驗組中,由于搖青工藝的開始,T1中所測得的α-法呢烯的組分相對含量為0.2465%,低于SW所測得的α-法呢烯的組分相對含量0.3916%,這表明搖青機(jī)械力的介入降低了樣品茶葉的α-法呢烯的含量。但是隨著加工工藝的推進(jìn),搖青所帶來的機(jī)械脅迫可以提高茶葉中的α-法呢烯的含量。對比實驗組中三次搖青之間的α-法呢烯的組分相對含量,可得三個數(shù)值之間存在明顯差異,T1所測得的數(shù)值約為T2所測得的數(shù)值的40%,T2所測得的數(shù)值約為T3所測得數(shù)據(jù)的70%。對照組的α-法呢烯的組分相對含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,伴隨著茶葉自身水分的逸失,α-法呢烯的組分相對含量在CK3處達(dá)到攤晾過程中的最高值,數(shù)值為0.4273%。實驗組和對照組對比中,T1和CK1存在差異,T2和CK2、T3和CK3組間存在極顯著差異(P<0.01)。這說明,隨著茶鮮葉的失水及機(jī)械脅迫的累加,茶葉中α-法呢烯的含量逐漸增加,成為影響烏龍茶成茶香氣的重要成分。

圖3 烏龍茶加工過程樣的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion flow chromatogram of oolong tea processing samples注:箭頭表示基于NIST數(shù)據(jù)譜庫鑒定出的α-法呢烯的離子峰。

圖4 烏龍茶加工過程中α-法呢烯組分相對含量的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of α-Farnesene contentin different oolong tea manufacturing process注:F表示鮮葉;SW表示萎凋葉;T1表示第一次搖青葉;T2表示第二次搖青葉;T3表示代表第三次搖青葉。

圖柱上不同小寫字母表示不同時間點的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05),大寫字母表示不同時間點的表達(dá)量存在極顯著差異(P<0.01),*表示實驗組和對照組間獨立樣本t檢驗存在顯著性差異(P<0.05),**表示實驗組和對照組間獨立樣本t檢驗存在極顯著性差異(P<0.01)；圖7同。

2.2 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的α-法呢烯合成酶基因的篩選

本課題組先前完成了烏龍茶初制過程中關(guān)鍵節(jié)點(鮮葉、萎凋葉、做青葉、對照攤放葉)的轉(zhuǎn)錄組測序,通過本地Blast后,將1.2.3中檢索獲得的α-法呢烯合成基因得到逐一比對,結(jié)果如表2所示,基于Blast得分和E值,將CL11384.Contig7_All作為候選CsAFS基因。

將候選的CL11384.Contig7_All與1.2.3中的11條α-法呢烯合成相關(guān)基因比對后,發(fā)現(xiàn)TEA033306.1、TEA009170.1、TEA026271.1與CL11384.Contig7_All具有高度的同源性。通過TPIA網(wǎng)站查詢并對比的這三條α-法呢烯合成酶相關(guān)基因在不同山茶屬植物中的表達(dá)水平,結(jié)果如圖5所示,TEA026271.1基因僅在茶中表達(dá)水平較高(0.23),在列舉的其余同屬植物中普遍表達(dá)水平偏低,甚至不表達(dá);TEA009170.1基因在茶(原變種)中表達(dá)水平最高(1.6),在龍井43中表達(dá)水平次之(1),在茶中則無明顯表達(dá)水平;TEA033306.1整體表達(dá)水平較其它兩個基因的表達(dá)水平高,在茶(原變種)中表達(dá)水平最高(2.75),在茶、龍井43中表達(dá)水平較高,分別為1、2。通過對比這三個基因在山茶屬植物中的基因表達(dá)水平,可以得出在進(jìn)化和演變的過程中,具有較高相關(guān)基因表達(dá)水平的茶(原變種)、茶被篩選出來,通過加工帶來的外源脅迫促使葉片中相關(guān)基因表達(dá),從而累積形成茶葉的賦香物質(zhì)。

通過Me_V軟件做圖后對比篩選出的5個轉(zhuǎn)錄本的FPKM值熱圖,結(jié)果如表3所示。僅考慮表達(dá)值(FPKM)大于10 的轉(zhuǎn)錄本[32],可知CL11384.Contig7_All表達(dá)值在搖青葉(T3)及其對照葉(CK3)分別為40.29和11.41,Unigene14516_All的表達(dá)值在T3中為12.74,而其余三個轉(zhuǎn)錄本(Unigene14691_All、Unigene32162_All、CL4238.Contig1_All)在各處理中FPKM均小于10,故舍棄。盡管差異性分析表明CL11384.Contig7_All和Unigene14516_All的T3和CK3的FPKM均存在極顯著差異(P<0.01),但通過對比二者T3和CK3的倍數(shù)差異(Fold_Change,FC)后發(fā)現(xiàn),CL11384.Contig7_All的FC(T3_vs_CK3)為3.53,而Unigene14516_All的FC(T3_vs_CK3)僅為1.40。因此將CL11384.Contig7_All作為候選基因進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 基于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄組中α-法呢烯合成酶基因的本地BlastTable 2 Local blast of CsAFS7 gene based on tea tree genemo database

表3 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的α-法呢烯合成酶基因在加工過程中的表達(dá)值(FPKM)Table 3 Expression value(FPKM)of CsAFS gene during manufacturing process of oolong tea based on transcriptome data

圖5 α-法呢烯合成酶基因的在不同山茶屬植物中的表達(dá)水平Fig.5 CsAFS gene expression levelin various Camellia species

利用MegaV_7.0結(jié)合在線工具iTOL(http://itol.embl.de/upload.cgi)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得的CL11384.Contig7_All核酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖6所示。結(jié)果表明,該基因的轉(zhuǎn)錄本與茶樹α-法呢烯合成酶基因(CsAFS)高度相似(Q_Cover=100%,E_value=0,Per. Ident=99.94%),與兩個茶樹萜烯類合成酶基因(CsTPS6、CsTPS9)存在較高的同源性。除茶樹中的法呢烯合成酶基因外,還對比獲得了一條歐洲栓皮櫟的(E,E)-AFS基因,但與轉(zhuǎn)錄本CL11384.Contig7_All的相似度較低。通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,進(jìn)一步確定了轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得的CL11384.Contig7_All來自于茶樹中的α-法呢烯合成酶基因的轉(zhuǎn)錄,因此將CL11384.Contig7_All命名為CsAFS7。

圖6 基于CL11384.Contig7_All核酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on nucleic sequences homology of CL11384.Contig7_All

2.3 烏龍茶加工過程中CsAFS基因的表達(dá)水平和驗證

AFS基因的表達(dá)對α-法呢烯合成與代謝有關(guān)鍵作用[33]。因此,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),根據(jù)qRT-PCR結(jié)果中CsAFS7基因的表達(dá)量水平衡量茶葉在加工過程中的α-法呢烯含量水平,結(jié)果如圖7所示,隨著烏龍茶加工的進(jìn)展,CsAFS7基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,在鮮葉階段CsAFS7的表達(dá)水平最低,在第三次搖青葉處測得最高值(46.649)。

圖7 烏龍茶加工過程中相關(guān)CsAFS7基因的相對表達(dá)水平Fig.7 CsAFS7 gene relative expression levelduring oolong tea manufacturing process

實驗組中,T1處的CsAFS7表達(dá)水平約為T2處的26%,T2處的CsAFS7基因表達(dá)水平約為T3處的48%。對照組中,CsAFS7基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在CK2處表達(dá)水平最高(14.003),在CK3時CsAFS7基因的表達(dá)水平明顯下降至最低值(0.766)。說明了茶葉在攤晾過程中受到的非生物脅迫對CsAFS7的表達(dá)水平有一定影響,但隨著自身水分的逸失,CsAFS7基因的表達(dá)水平逐漸降至最低。

實驗組與對照組的對比中,T3與CK3的組間基因表達(dá)水平存在極顯著差異(P<0.01)。說明了烏龍茶加工過程中,CsAFS7在外來機(jī)械力的作用下有較高的表達(dá)模式,且隨著機(jī)械脅迫作用的累加逐漸升高。

2.4 烏龍茶加工過程中α-法呢烯含量與CsAFS基因相對表達(dá)水平的相關(guān)性分析

利用皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)評估茶樹CsAFS7基因的表達(dá)水平與α-法呢烯含量的相關(guān)性,結(jié)果如表4所示。實驗組中CsAFS7基因的表達(dá)水平與α-法呢烯含量存在極顯著正相關(guān)(r=0.951,P<0.01)。對照組中,CsAFS7基因的表達(dá)水平與α-法呢烯含量不存在顯著差異(r=-0.192)。由此推測,外源機(jī)械力的施加促使相關(guān)CsAFS基因的表達(dá)水平上調(diào),進(jìn)而提高α-法呢烯的含量。

表4 烏龍茶加工過程中α-法呢烯豐度與CsAFS7基因相對表達(dá)水平的相關(guān)性分析Table 4 Correlation coefficient between α-farnesenecontent and relative expression level of CsAFS7 gene

3 討論與結(jié)論

3.1 茶樹AFS關(guān)鍵基因在茶組植物中的特異表達(dá)

通過與其他茶組植物比較,α-法呢烯合成酶關(guān)鍵基因的表達(dá)水平在茶(原變種)、龍井43中普遍高于其他茶組植物。盡管“茶”中α-法呢烯合成關(guān)鍵基因TEA026271.1、TEA009170.1的表達(dá)量高于其他茶組近源植物,但是卻均低于“茶(原變種)”和“龍井43”。“茶(原變種)”的產(chǎn)生是人類將大葉茶向小葉茶、從喬木向灌木成功馴化的標(biāo)志[34-36],而龍井43則是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所在龍井群體種中選育出的國家優(yōu)良茶樹品種[37]。這或許可以解釋,帶有香氣的“茶”得到了人類的關(guān)注,在人類馴化和人工選育“茶”的過程中,香氣又是一個十分重要導(dǎo)向。同時,茶葉的采后處理促進(jìn)了香氣的進(jìn)一步釋放。Hu等[38]基于轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)烏龍茶在做青過程中MEP和MVA途徑上結(jié)構(gòu)基本呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的模式,這為包括α-法呢烯在內(nèi)的VOCs的形成及釋放研究奠定了基礎(chǔ)。Jin等[39]基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和代謝組測序數(shù)據(jù),建立起一個茶樹萜烯類代謝基因網(wǎng),發(fā)現(xiàn)一個與法呢烯形成有顯著正相關(guān)的萜烯類合成酶基因——TPS2,該基因與CsAFS基因具有較高的同源性,可以誘導(dǎo)α-法呢烯、β-法呢烯、β-羅勒烯的形成。本研究篩選獲得的CsAFS基因表達(dá)水平能促進(jìn)搖青工藝的推進(jìn),該基因?qū)Ζ?法呢烯的誘導(dǎo)作用,有助于把握不同加工階段烏龍茶風(fēng)味品質(zhì)的形成。

3.2 烏龍茶加工過程中α-法呢烯的形成和關(guān)鍵基因的表達(dá)

α-法呢烯是烏龍茶中關(guān)鍵的賦香物質(zhì)[40-41]?；诓煌募庸すに?茶葉被劃分為六大類,其中烏龍茶加工工藝最為繁雜[42],基于烏龍茶加工過程中關(guān)鍵節(jié)點樣品轉(zhuǎn)錄組測序,篩選獲得了轉(zhuǎn)錄本CL11384.Contig7_All,通過本地Blast后發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄組與TEA033306.1、TEA026271.1以及TEA009170.1具有較高的同源性,qRT-PCR的驗證后發(fā)現(xiàn)在做青葉中CL11384.Contig7_All的表達(dá)水平要明顯高于其他處理葉,并且與做青過程中α-法呢烯的累積存在極顯著的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.951(P<0.01),該結(jié)果進(jìn)一步說明了做青是烏龍茶天然馥郁花果香品質(zhì)形成的核心工藝。烏龍茶做青過程中,萎凋適度的鮮葉在反復(fù)的搖青和攤放過程中,葉片加速失水并產(chǎn)生局部損傷,包括α-法呢烯在內(nèi)的萜類[43]、脂肪族類[44-45]、苯丙烷及苯環(huán)類等[46]帶有芳香氣味的物質(zhì)逐步形成并釋放。與等時間未搖青的對照組(CK)相比,第三次搖青葉(T3)的α-法呢烯含量極顯著高于對照組(P<0.01),這說明搖青機(jī)械力在做青中后期的介入,CL11384.Contig7_All表達(dá)水平開始顯著上調(diào),α-法呢烯開始大量累積并釋放,因此這個階段可能是烏龍茶天然花果香品質(zhì)形成的關(guān)鍵時期。而有趣的是,T1中的α-法呢烯含量顯著低于CK1中的α-法呢烯含量(P<0.05)。這可能是在做青伊始階段,搖青機(jī)械力初次介入,與失水共同形成做青過程中的雙重脅迫效益[47],盡管關(guān)鍵基因CL11384.Contig7_All的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)完成,但生理層次上,相關(guān)酶力及α-法呢烯的含量尚未同步,這與Zhou等[48]研究中同樣指出了外源機(jī)械力的介入,初始LOX-HPL途徑上ADH酶活力及基因表達(dá)水平均呈現(xiàn)先下降而后升高的趨勢。Qian等[49]則闡釋了葡萄采后的過程中分子層次和生理層次的反應(yīng)差異,認(rèn)為生理層次的反應(yīng)要普遍滯后于分子層次。與本研究不同,佛手品種在付制烏龍茶過程中,α-法呢烯不論是釋放量還是葉片中的殘余量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,而綠茶品種“浙農(nóng)319”則呈現(xiàn)不斷上升積累的趨勢[50],這種差異可能是烏龍茶品種和采后處理的差異導(dǎo)致。