龔新懷,2,李明春2,辛梅華2,趙曉杰,呂 橄,徐 婕，趙升云

(1.武夷學院生態(tài)與資源工程學院,福建省生態(tài)產業(yè)綠色技術重點實驗室,福建武夷山 354300;2.華僑大學材料科學與工程學院,環(huán)境友好功能材料教育部工程研究中心,福建廈門 361021)

目前全球每年茶葉消耗量超過450萬噸[1]。在茶葉種植、生產、加工及消費環(huán)節(jié)中會產生大量的茶渣剩余物,單中國每年可產生500萬噸以上的茶渣剩余物,其主要含有纖維素、木質素、半纖維素及茶多酚等活性組分[2]。茶多酚作為一種天然抗氧劑,具有抗癌癥、抗衰老及預防冠心病等作用,在保健品、化妝品、塑料工業(yè)及疾病治療等領域具有廣泛應用前景[3-6]。目前主要通過溶劑回流浸提茶葉來獲取茶多酚,但該工藝存在溶劑用量大、提取溫度偏高及后續(xù)需進一步純化操作等問題[7]。

雙水相系統(ATPS)是由兩種不相容的親水組分溶于水中,形成宏觀上可見的液液分相系統,被視為一種功能強大的非色譜過程,具有工藝簡單、成本低、易放大操作及條件溫和等優(yōu)勢,適用于蛋白質、核酸及抗體等生物活性分子的萃取、純化[8-10]。目標組分與ATPS中上下兩相通過電荷力、氫鍵及疏水作用等方式形成的親和力大小不同,進而在ATPS上下兩相發(fā)生選擇性分配,實現萃取、純化[11]。徐方祥等[12]采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系提取綠茶中茶多酚。陳鋼等[13]采用超聲耦合乙醇-硫酸銨組成的雙水相體系提取茶多酚,并對工藝進行了響應面優(yōu)化。林維晟等[14]采用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相的方法對碎銅茶中茶多酚進行提取。

此外,為促進目標組分在ATPS對應相中的富集,研究者主要通過改變相組成物質分子量和濃度來調節(jié)上下相的性質,調控其與目標組分的親和力,調控手段較單一、作用效果有限。離子液體(ionic liquid,IL)是一類由體積較大的有機陽離子和有機或無機陰離子組合成的,在100 ℃以下為液體的鹽[15],具有低揮發(fā)、無毒性等優(yōu)勢,可通過不同結構和電荷性質的陰陽離子組合,來溶解許多不同極性大小和特點的組分[16]。研究表明[17-18],將IL作為一種調節(jié)助劑添加到ATPS中,可調節(jié)上下相的物化性質,提高其對目標組分的萃取能力和適用范圍。Joao等[19]將咪唑基離子液體添加于聚乙二醇/磷酸鉀雙水相體系,用于提取抗氧化劑丁香酚和沒食子酸丙酯,發(fā)現離子液體添加可以提高雙水相體系的萃取效率。Almeida等[18]將離子液體添加于聚乙烯醇/硫酸鈉雙水相體系中,用于3種抗氧化組分沒食子酸、香草酸及丁香酸的萃取。發(fā)現離子液體[C4mim]Cl或[C4mim][CH3CO2]的添加顯著提高了雙水相體系對沒食子酸的萃取能力,并可實現對3種組分良好的萃取分離。

因此將離子液體添加到傳統雙水相體系中,有助于茶多酚的提取、純化過程,但這方面研究尚未見報道。本研究采用離子液體(ionic liquids,IL)輔助乙醇/硫酸銨ATPS來提取茶渣中茶多酚,系統考察了不同結構ILs對乙醇/硫酸銨ATPS分相行為及其對茶多酚浸提能力等的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶渣,綠碎茶加工下腳料 湖北隨州神農茶葉有限公司,用前晾干,并在105 ℃下鼓風干燥12 h,機械研磨,用標準分樣篩取用粒徑<300 μm的茶粉備用;硫酸銨、無水乙醇、七水合硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 AR，國藥試劑;沒食子酸、1,1-二苯基-2-苦基肼及抗壞血酸 上海源葉生物科技有限公司,HPLC含量≥98%;1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4mim]BF4)、溴化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Br)、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽([C4mim]NO3)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4mim]PF6)、氯化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Cl)、1-丁基-1-甲基哌啶氯化物([C4mpip]Cl)、1-丁基-1-甲基吡咯烷酰氯([C4mpyr]Cl)、氯化1-己基-3-甲基咪唑([C6mim]Cl)及氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Cl) 上海程捷化學有限公司,質量分數>98%。

1000Y型多功能粉碎機 永康市伯歐五金制品有限公司;S10H型超聲波清洗機 廈門致微儀器有限公司;SC-04型低速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;ΜV-1100型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀 美國Agilent。

1.2 實驗方法

1.2.1 IL輔助ATPS提取茶渣中茶多酚 吸取一定量乙醇溶液,加入預定質量的硫酸銨及IL,超聲(功率為270 W)輔助溶解15 min后,再取出靜置分相10 min,然后讀取、記錄上下相的體積,即得到IL輔助的乙醇/硫酸銨ATPS。另取一只干凈、干燥的塑料離心管,加入預定質量的茶渣,然后加入前述配制好的IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS,超聲水浴提取至預定時間后,轉入離心機中在4000 r/min下離心10 min,茶多酚富集于上層乙醇相清液中,待測定其濃度。平行操作2份,取平均值。

1.2.2 IL的選擇

圖1 不同IL的化學結構式Fig.1 Chemical structures of ILs注:(a)[C4mim]BF4;(b)[C4mim]Br;(c)[C4mim]PF6;(d)[C8mim]Cl;(e)[C4mim]NO3;(f)[C4mim]Cl;(g)[C6mim]Cl;(h)[C4mpyr]Cl;(i)[C4mpip]Cl。

1.2.2.1 不同結構IL篩選 通過IL中不同陰陽離子結構的選用與組合,得到不同親疏水性的IL,可調控雙水相體系的分相行為及其對活性組分的萃取分離能力,實現對各種物化性質不同的目標組分進行提取或純化。為考察不同結構組成IL對乙醇/硫酸銨ATPS的分相行為及其對茶多酚得率影響,試驗選用了9種不同化學結構IL,分別為1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4mim]BF4)、溴化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Br)、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽([C4mim]NO3)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C4mim]PF6)、氯化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Cl)、1-丁基-1-甲基哌啶氯化物([C4mpip]Cl)、1-丁基-1-甲基吡咯烷酰氯([C4mpyr]Cl)、氯化1-己基-3-甲基咪唑([C6mim]Cl)及氯化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Cl),其化學結構如圖1所示。

1.2.2.2 不同IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的分相能力 a.乙醇/硫酸銨相圖繪制(即對照組):參照盧艷敏[20]的方法,采用濁點滴定法繪制ATPS相圖。配制質量分數為40%的硫酸銨溶液,量取25.00 g于刻度容器內,置于25 ℃的恒溫水浴鍋中。緩慢滴加無水乙醇,至其恰好出現渾濁時停止滴加,記錄此時乙醇加入量,計算硫酸銨質量分數和乙醇體積分數;滴加少量去離子水使體系澄清,記錄水加入質量,再繼續(xù)滴加無水乙醇至濁點剛好出現。如此反復操作和計算,得到一系列不同組成的濁點。

b.不同IL輔助乙醇/硫酸銨相圖繪制:按a法準備質量分數為40%的硫酸銨溶液、無水乙醇及水,并分別在其中加入1.25 g的[C4mim]Cl,得到含[C4mim]Cl質量分數為5%的硫酸銨溶液、無水乙醇及水。其余按a法操作,即得到含[C4mim]Cl質量分數為5%的濁點曲線。同法可繪制含其他不同化學結構IL的濁點曲線。

c. 不同IL添加量輔助乙醇/硫酸銨相圖繪制:按b法繪制含[C4mim]Cl質量分數分別為0、5%、10%及15%的乙醇/硫酸銨濁點曲線。

1.2.2.3 不同IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS體系對茶多酚得率和抗氧化性的影響 固定乙醇體積分數50%,硫酸銨質量分數40%,茶渣與IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的料液比為1∶35 g/mL(簡寫成1∶35),IL添加質量分數為5%條件下,考察不同結構IL添加對茶多酚得率及對抗氧化性的影響,其中抗氧化性測試是利用茶多酚提取液對1×10-4mol·L-1的1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)的半抑制濃度為指標,并以無水乙醇替代試液作為初始對照值。

1.2.2.4 [C4mim]Cl用量對茶多酚得率和抗氧化性的影響 固定乙醇體積分數50%,硫酸銨質量分數40%,料液比1∶35,考察[C4mim]Cl添加量對茶多酚得率和抗氧化性的影響,其中抗氧化性測試同1.2.2.3。

1.2.3 [C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS提取茶多酚工藝的單因素實驗

1.2.3.1 乙醇體積分數對提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質量分數為10%,硫酸銨質量分數為25%,料液比1∶35,溫度45 ℃,提取時間10 min,超聲功率540 W,乙醇體積分數為30%、40%、50%、60%和70%時,考察乙醇體積分數對茶多酚得率的影響。

1.2.3.2 硫酸銨質量分數對提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質量分數為10%,料液比為1∶35,溫度45 ℃,提取時間10 min,超聲功率540 W,乙醇體積分數為60%,硫酸銨質量分數為15%、20%、25%、30%、35%及40%時,考察硫酸銨質量分數對茶多酚得率的影響。

1.2.3.3 料液比對提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質量分數為10%,硫酸銨質量分數為30%,提取溫度45 ℃,提取時間10 min,超聲功率540 W,乙醇體積分數為60%,料液比為1∶25、1∶35、1∶45、1∶55及1∶65 (g/mL)時,考察料液比對茶多酚得率的影響。

1.2.3.4 提取溫度對提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質量分數為10%,硫酸銨質量分數為30%,料液比為1∶35,提取時間10 min,超聲功率540 W,乙醇體積分數為60%,溫度為35、40、45、50及55 ℃時,考察提取溫度對茶多酚得率的影響。

1.2.3.5 提取時間對提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質量分數為10%,硫酸銨質量分數為30%,料液比為1∶35,提取溫度為50 ℃,超聲功率540 W,乙醇體積分數為60%,提取時間為5、10、15、20及25 min時,考察提取時間對茶多酚得率的影響。

1.2.3.6 超聲功率對提取茶多酚工藝的影響 固定[C4mim]Cl添加質量分數為10%,硫酸銨質量分數為30%,料液比為1∶35,提取溫度為50 ℃,提取時間10 min,乙醇體積分數為60%,超聲功率為360、450、540、630及720 W時,考察超聲功率對茶多酚得率的影響。

1.2.4 [C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS提取茶多酚工藝的正交試驗 基于單因素實驗結果,以茶多酚得率為指標,采用正交試驗法對乙醇體積分數、硫酸銨質量分數、料液比及超聲功率四個影響因素進行優(yōu)化,正交優(yōu)化因素及水平如表1所示,固定[C4mim]Cl添加質量分數為10%。

表1 正交優(yōu)化因素選擇Table 1 Factor design of orthogonal experiment

1.2.5 不同體系對茶多酚得率及組成的影響

1.2.5.1 不同體系對茶多酚得率的影響 實驗比較0.10 g·mL-1的[C4mim]Cl輔助C2H5OH/(NH4)2SO4ATPS與其他提取體系如水、50%乙醇溶液、PEG6000/Na3C6H5O7ATPS、C2H5OH/Na2HPO4ATPS、C2H5OH/(NH4)2SO4ATPS、PEG6000/Na3C6H5O7/[C4mim]Cl ATPS對茶多酚得率的差別,其中乙醇體積分數50%,PEG6000質量分數50%及鹽質量分數25%,超聲溫度45 ℃、超聲時間10 min、超聲功率540 W、料液比1∶35。茶多酚得率測定見1.2.6。

1.2.5.2 茶多酚提取液組成分析 參照國標GB/T 8313-2008[21]方法,采用HPLC測定茶渣多酚提取液的組成。色譜條件:色譜柱C18柱(粒徑5 μm,250 mm×4.6 mm);將10 mL乙酸轉入1000 mL容量瓶,用純凈水定容后,過0.45 μm濾膜,得流動相A;將800 mL乙腈、10 mL乙酸轉入1000 mL容量瓶中,用純凈水定容后,過0.45 μm濾膜,得流動相B。梯度條件:0 min(5%B)→21 min(85%B)→32 min(100%B)→37 min(0%B)→42 min(0%B)。檢測波長278 nm,流動相流速1 mL·min-1。

定性及定量分析方法:參照文獻[22],定性及定量分析組分峰:兒茶素(保留時間5.36 min)、表兒茶素(保留時間7.41 min)、沒食子兒茶素(保留時間4.37 min)、表兒茶素表沒食子酸酯(保留時間8.98 min)及表沒食子兒茶素表沒食子酸酯(保留時間7.12 min)。用HPLC儀器自帶分析軟件對組分峰面積進行積分,根據其峰面積算出對應組分含量。

1.2.6 提取液中茶多酚得率和抗氧化性的測定

1.2.6.1 提取液中茶多酚濃度測定 采用沒食子酸標準曲線法,按國標GB/T 8313-2002[23]測定上相清液中茶多酚的濃度,標準曲線方程為y=0.09245x+0.02482,R2=0.9993。用移液槍移取上層清液1.00 mL于25.00 mL比色管中,加去離子水4.00 mL,酒石酸亞鐵溶液5.00 mL,充分混勻后,加入pH=7.5的緩沖液至刻度線,定容。然后用1.00 cm比色皿在波長540 nm下測定吸光度,以試劑空白為參比。

1.2.6.2 提取液中茶多酚得率計算 按下式計算茶多酚得率。

式中:c為ATPS上層清液中茶多酚的濃度,mg·mL-1;v為ATPS上層清液的體積,mL;m為稱取的茶渣質量,g。

1.2.6.3 茶多酚提取液抗氧化性測定 參照李曉靜等[24]的方法,配制1×10-4mol·L-1的1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)溶液后,分別取5.00 mL茶多酚提取液和DPPH溶液,于暗處混勻并靜置30 min,然后將混合液在紫外分光光度儀上于517 nm測定吸光度,以無水乙醇替代試液作為初始對照值。使DPPH溶液吸光度值下降一半時對應的茶多酚濃度,即為茶多酚提取液對DPPH自由基的半抑制濃度,記錄為C50%(DPPH),用作茶多酚的抗氧化性指標。

1.3 數據處理

根據實驗測試過程的數據記錄,及儀器測試數據導出后,將其錄入到Origin軟件中,用Origin軟件繪制曲線及圖形。

2 結果與分析

2.1 IL在乙醇/硫酸銨ATPS體系中的選擇

2.1.1 IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的分相行為 IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的相圖如圖2所示,其中溫度為298 K。由于實驗數據較多,以及部分試劑采購量較少,量不足以完成相圖繪制,因此只做了6種不同IL輔助乙醇/硫酸銨雙水相系統的相圖。圖2中濁點線上方為兩相區(qū)域,下方為單相區(qū)域。兩相區(qū)域越大,表示雙水相體系中上下兩相之間的分相能力越強[18]。由圖2a可知,不同IL的加入,明顯增大了兩相區(qū)域面積,其中以[C4mim]Cl的輔助分相能力最好。由圖2b可知,隨[C4mim]Cl用量增加,乙醇與硫酸銨雙水相體系的兩相區(qū)域面積越大。由此可知IL加入提高了乙醇/硫酸銨ATPS的分相能力。這是由于[C4mim]Cl是由有機陽離子和無機陰離子組成,比乙醇具有更高的親水性,可與更多的水分子發(fā)生水合作用,導致乙醇分子更容易被驅離成相,提高體系的分相能力[25]。

圖2 IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS的相圖Fig.2 Phase diagrams of C2H5OH/(NH4)2SO4 ATPS added with ILs注：(a)不同類型ILs;(b)不同添加量[C4mim]Cl。

2.1.2 IL化學結構對茶多酚得率和抗氧化性的影響

2.1.2.1 IL化學結構對茶多酚得率的影響 不同化學結構IL輔助乙醇/硫酸銨ATPS對茶多酚得率及其抗氧化性的影響見圖3和圖4。由圖3可知,未添加IL的ATPS對茶渣(tea waste,TW)中茶多酚得率僅為42.11±0.55 mg·g-1,IL的添加不同程度提高了茶多酚得率。這是由于在乙醇/硫酸銨ATPS中,上相為乙醇富集相,下相為鹽富集相,茶多酚傾向分布在更加疏水和低電荷的乙醇富集相中。ATPS對目標組分能夠實現有效萃取、富集,主要是兩相中組分與目標組分各種作用力的平衡結果,這種作用驅動力包括疏水作用、氫鍵、靜電作用以及π-π鍵共軛作用等,能夠強化這種驅動力的手段就能夠促進目標組分在對應相中的富集[17]。如IL中陽離子結構可與茶多酚形成氫鍵,咪唑環(huán)上π電子可以和茶多酚的π電子發(fā)生π-π共軛作用,促進茶多酚在乙醇相中的富集[18]。此外,IL中陰離子基團可以接受茶多酚中的質子等[26],有利于茶多酚組分的溶出及被乙醇相富集,提高茶多酚得率[17]。

對于IL中陽離子結構而言(如圖3a所示),咪唑環(huán)陽離子相比于哌啶型和吡咯型IL,具有更高的茶多酚得率,這主要是由于咪唑環(huán)屬于芳香環(huán),具有π電子可以和茶多酚發(fā)生π-π電子共軛作用,此外咪唑環(huán)上含有兩個N原子,與茶多酚組分形成的氫鍵作用更大[18]。咪唑環(huán)上的側鏈越長,其疏水性增加,對中性的茶多酚分子具有更高的親和性[25]。對于吡咯環(huán)和哌啶環(huán)兩個非芳香性的環(huán),六元環(huán)的哌啶環(huán)具有更高的疏水性,從而對中性茶多酚分子具有更高的親和性。但由于[C4mim]Cl性價比最高,因此后續(xù)選擇[C4mim]Cl。此外從圖3b可知,固定陽離子結構為[C4mim],IL中不同陰離子結構對茶多酚得率影響大小順序為:Br>BF4>Cl>NO3>PF6。且IL中陽離子結構變化對茶多酚得率的影響要大于陰離子結構變化的影響。

圖3 IL化學結構對茶多酚得率的影響Fig.3 Effects of ILs chemical structureson the extraction yields of polyphenols注:(a)IL中不同陽離子結構的影響;(b)IL中不同陰離子結構的影響;圖4同。以no IL數據為對照組，與之相比，*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),未標注表示差異不顯著;圖4、表5同。

2.1.2.2 IL化學結構對茶多酚抗氧化性的影響 不同化學結構的IL添加對茶多酚提取物的抗氧化活性影響如圖4所示。未添加IL時,乙醇/硫酸銨雙水相體系提取的茶多酚對DPPH自由基作用30 min時的半抑制濃度僅為1.43 μg·mL-1,表明茶多酚具有高效的抑制自由基能力,具有良好的抗氧化、抗老化作用。IL輔助后的茶多酚提取物對DPPH自由基的半抑制濃度雖有微弱升高,但都呈現為很低的濃度值(<2.00 μg·mL-1),說明試驗選用的IL對茶多酚的抗氧化活性幾乎沒有抑制作用。

圖4 IL化學結構對多酚提取液抗氧化性的影響Fig.4 Effects of ILs chemical structureson the antioxidant properties of the extraction

IL的加入雖然可以改變給定相的理化性質,調節(jié)其對目標組分的萃取或純化能力,但由于IL通常成本較高,因此少量添加比較合適。綜合考慮IL添加成本及輔助作用(如表2所示),其中價格/性能比值由25 g售價/茶多酚得率來簡單估算,比值越小越好。由表2數據可知,[C4mim]Cl輔助的比值最小,因此后續(xù)試驗選擇[C4mim]Cl為添加輔助劑。

表2 不同離子液體性價比的比較Table 2 Comparison of cost and performance of ILs

2.1.3 [C4mim]Cl用量對茶多酚得率和抗氧化性的影響 [C4mim]Cl添加量對茶多酚得率和抗氧化性的影響結果如圖5所示。由圖5可知,隨[C4mim]Cl用量增加,茶多酚得率逐漸提高,在[C4mim]Cl添加質量分數為10%時,茶多酚得率為75.52±0.75 mg·g-1,比未添加ILs時提高了79.34%。[C4mim]Cl添加并未影響茶多酚提取液的抗氧化性,提取液對DPPH自由基半抑制濃度保持在很低的濃度值范圍(<2.00 μg·mL-1)。茶多酚在酸性環(huán)境中具有很好的穩(wěn)定性,在乙醇/硫酸銨ATPS中,硫酸銨的存在使體系能夠維持弱酸性環(huán)境,保證了茶多酚提取液的活性。

圖5 [C4mim]Cl添加量對體系提取茶多酚的影響Fig.5 Effects of [C4mim]Cl contenton the extraction properties of polyphenol注:(a)茶多酚得率;(b)茶多酚提取液的抗氧化性。

2.2 [C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS提取茶多酚工藝的單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分數對提取茶多酚工藝的影響 隨乙醇體積分數增加,體系對茶多酚得率先增后減,在乙醇體積分數為60%時達到最大(如圖6a所示)。乙醇用量增加,可與更多茶多酚組分發(fā)生作用,有助于茶多酚浸提,但用量過多會導致其他組分如蛋白質、多糖等沉淀,吸附部分茶多酚[27],降低其茶多酚得率。

2.2.2 硫酸銨質量分數對提取茶多酚工藝的影響 硫酸銨用量增加,其鹽析作用增強,使更多乙醇分子聚集而為醇相,對茶多酚提取能力提高。但鹽過多會吸附水而使乙醇相體積變小,對茶多酚得率下降[28]。因此硫酸銨最佳添加質量分數為30%(如圖6b所示)。

2.2.3 料液比對提取茶多酚工藝的影響 隨ATPS用量增加,茶多酚得率先增大后減小,在料液比為1∶35時最大(圖6c)。這是由于體系用量增大,其對茶粉的滲透作用更充分,使內部的茶多酚被浸提出來;但溶劑用量過多,會導致部分多糖、蛋白質沉析,會吸附部分茶多酚使多酚得率下降。

2.2.4 提取溫度對提取茶多酚工藝的影響 提取溫度增加,溶劑分子活動能力增強,有利于體系對茶粉中茶多酚組分的浸提作用,茶多酚得率提高(如圖6d)。但溫度提高也會使茶多酚的穩(wěn)定性下降[29]。因此綜合考慮,[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨雙水相體系提取茶多酚的適宜溫度為50 ℃。

2.2.5 提取時間對提取茶多酚工藝的影響 隨體系提取茶渣時間的延長,茶多酚得率先快速增加,然后變緩慢并趨于平衡(如圖6e所示)。浸提時間延長,可使體系對茶粉中茶多酚發(fā)生更充分的浸提,當浸提時間延長到10 min以后,雙水相體系對茶多酚的浸提作用基本達到極限,因此表現為茶多酚得率趨于平衡。因此提取適宜時間為10 min。

2.2.6 超聲功率對提取茶多酚工藝的影響 隨超聲功率增加,茶多酚得率先增加后減小,在超聲功率為540 W時得率最高。這是由于超聲功率增強,體系對茶粉的振蕩作用加強,有利于其對茶多酚的浸提作用。但超聲功率過強,可能會使茶粉中部分多糖、蛋白質等沉析出來,反而降低了茶多酚得率。

圖6 不同因素對[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS提取茶多酚工藝的影響Fig.6 Effects of single factors on extraction of polyphenol by C2H5OH/(NH4)2SO4 ATPS added with[C4mim]Cl注:(a)乙醇體積分數的影響;(b)硫酸銨質量分數的影響;(c)料液比的影響;(d)提取溫度的影響;(e)提取時間的影響;(f)超聲功率的影響。

2.3 茶多酚提取工藝的正交試驗優(yōu)化

基于2.2實驗結果,以茶多酚得率為指標,用正交試驗法對乙醇體積分數、硫酸銨質量分數、料液比及超聲功率四個因素進行優(yōu)化,結果如表3及表4所示。從表4可知,對茶多酚得率影響大小順序依次是乙醇體積分數>硫酸銨質量分數>料液比>超聲功率,最佳因素組合為A2B2C3D2,即乙醇體積分數60%、硫酸銨質量分數30%、料液比1∶40和超聲功率540 W,此條件下,平行結果分別為87.54、83.78、84.98及85.33 mg·g-1,平均值85.31±1.25 mg·g-1。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment

2.4 不同體系提取茶多酚得率比較

實驗比較了質量分數為10%的[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS與其他提取體系,結果如表5所示。其中乙醇體積分數50%,PEG6000質量分數50%及鹽質量分數25%,超聲溫度45 ℃、超聲時間10 min、超聲功率540 W、料液比1∶35。從表5可知,水浸提茶多酚得率僅為31.37±0.09 mg·g-1,有機溶劑乙醇的加入使茶多酚得率提高至39.61±1.41 mg·g-1,當乙醇溶液與無機鹽組成ATPS后,茶多酚得率提高至42.11±0.55 mg·g-1,表明ATPS是一種具有較高效率的茶多酚提取方法。而離子液體[C4mim]Cl的加入,極顯著提升了ATPS對茶多酚的得率(P<0.01),在[C4mim]Cl輔助乙醇/磷酸氫二鈉及聚乙二醇2000/檸檬酸鈉ATPS中,同樣可看到IL添加對ATPS體系提取茶多酚得率有明顯改善作用。表明IL輔助雙水相體系提取茶多酚方法具有明顯優(yōu)勢。

表4 正交試驗結果分析Table 4 Analysis results of orthogonal experiment

表5 不同體系提取茶渣多酚提取液中兒茶素成分含量比較Table 5 Comparison in yields of polyphenol extracted by different methods

2.5 茶多酚提取液組成分析

[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS與其他體系提取茶渣多酚提取液的HPLC譜圖如圖7所示,其中[C4mim]Cl質量分數10%,乙醇體積分數50%。由于組分Na2HPO4、Na3C6H5O7存在使體系呈堿性,會使茶多酚變性,喪失活性,而組分(NH4)2SO4存在可使體系呈弱酸性,對茶多酚活性無損傷。因此僅研究了水、50%乙醇溶液、乙醇/硫酸銨ATPS及[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS四種系統對茶多酚提取液的組成。從圖7中可知,水、50%乙醇溶液、乙醇/硫酸銨ATPS及[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS對茶渣多酚提取液的HPLC譜圖中各峰保留時間基本一致,但各峰的峰高及峰面積存在差異。峰位置不同,代表不同組分,峰面積大小及其百分比則代表了該組分的含量。茶渣多酚提取液中主要含有茶多酚及咖啡因(CAF)等組分,茶多酚主要成分為兒茶素類物質,其是由兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素(GC)、表兒茶素表沒食子酸酯(ECG)及表沒食子兒茶素表沒食子酸酯(EGCG)等組成,各種兒茶素成分的保留時間[22]如表6所示。[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS與其他體系提取茶渣多酚提取液中主要成分含量的測定結果如圖7、表6及表7所示。

表7 不同體系提取茶渣多酚提取液中兒茶素成分含量比較(%)Table 7 Comparison of the catechin content in extraction of polyphenol extracted by different methods(%)

圖7 不同體系提取茶渣中多酚提取液的HPLC譜圖Fig.7 HPLC spectrums of the extraction ofpolyphenol extracted by different methods

表6 茶渣提取液中主要成分及其保留時間Table 6 The main components in theextraction and it’s retention time

從表7中數據可知,水溶劑提取法對茶多酚的萃取能力最弱,其提取液中各種組分含量也最低。有機溶劑乙醇的加入,使其提取茶多酚能力有所提高,各種組分含量也有所增加。無機鹽分硫酸銨的加入可與乙醇溶液形成雙水相系統,進一步提高了體系對多酚組分的萃取能力,且提取液中兒茶素類物質組分的含量有所提高。[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS對茶多酚提取能力最高,其對茶渣的提取液中各種兒茶素類物質組分含量也最大。這主要是由于乙醇分子與茶多酚組分間作用力更強,乙醇引入可以提高體系的提取茶多酚能力。雙水相體系作為一種液液分相的非色譜過程,可對目標組分實現分配,進行一定程度的富集作用,使組分含量和純度提高[12];[C4mim]Cl的少量輔助,通過調節(jié)乙醇/硫酸銨上下相性質,提高了ATPS的分相能力和富集茶多酚能力。將這5種兒茶素類組分含量總和作為多酚提取液中兒茶素的總量,則可計算出[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS對茶渣的多酚提取液中兒茶素總量為25.49%,其比水溶劑、50%乙醇溶液及乙醇/硫酸銨ATPS提取液中兒茶素含量分別提高了205.27%、42.24%及11.70%。

3 結論

IL的加入使乙醇/硫酸銨ATPS相圖中的兩相區(qū)域面積增大,分相能力提高,IL加入量增加,乙醇與硫酸銨的分相能力提高。

通過對[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS茶多酚工藝的正交試驗優(yōu)化考察,發(fā)現各因素按影響大小順序依次為乙醇體積分數>硫酸銨質量分數>料液比>超聲功率,最佳工藝條件為乙醇體積分數為60%、硫酸銨質量分數為30%、料液比為1∶40 g/mL和超聲功率為540 W,在此條件下,茶多酚得率為85.31±1.25 mg·g-1。

IL添加對ATPS體系提取茶多酚得率有明顯改善作用,且[C4mim]Cl輔助乙醇/硫酸銨ATPS對茶渣中茶多酚得率明顯高于其他體系,其提取液中兒茶素類組分含量更高,達到25.49%,比水溶劑、50%乙醇溶液及乙醇/硫酸銨ATPS提取液中兒茶素類組分總量分別提高了205.27%、42.24%及11.70%。

離子液體種類多、結構雜,其他不同結構組成離子液體對茶多酚得率及其影響機制,有待進一步研究。