陳 燦 張艷玲 劉小慶 冉鳳偉

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，且近年來(lái)的發(fā)病率呈不斷升高的趨勢(shì)[1]，但具體的機(jī)制并未闡明。雖然隨著新型放化療方案及新型靶向治療藥物的問(wèn)世及應(yīng)用，結(jié)直腸癌的治療手段不斷豐富，但中晚期結(jié)直腸癌患者的整體預(yù)后并不理想[2]。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要原因，而癌細(xì)胞的增殖和侵襲又與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，探明直腸癌增殖及侵襲的調(diào)控機(jī)制對(duì)深入認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制具有重大意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用的小分子RNA，多種miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中通過(guò)靶向原癌基因或抑癌基因而起到相應(yīng)作用。已有研究表明，miR-182在結(jié)直腸癌病灶內(nèi)呈顯著高表達(dá)[3-4]；另有研究證實(shí)，miR-182能夠靶向包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種癌細(xì)胞中的Foxo3a/Wnt/β-catenin通路[5]。基于此，本實(shí)驗(yàn)將探究miR-182對(duì)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及Foxo3a/Wnt/β-catenin通路的調(diào)節(jié)作用，旨在闡明miR-182在直腸癌發(fā)生中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集2016年6月—2019年7月在我院手術(shù)切除的直腸癌標(biāo)本及癌旁標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)后病理診斷為直腸癌且術(shù)前未接受過(guò)放化療。共56例直腸癌標(biāo)本及56例對(duì)應(yīng)的癌旁標(biāo)本，年齡42～62歲，平均51.38±9.82歲，男性36例，女性20例。

1.2 材料

直腸癌細(xì)胞株HT29、SW620、HCT-116及正常腸上皮細(xì)胞HIEC胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；Lipofectamine2000試劑購(gòu)自Invitrogen公司；miR-182模擬物、陰性對(duì)照(NC)模擬物購(gòu)自上海吉瑪公司；miRNA提取試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；MTS試劑盒購(gòu)自Promega公司，F(xiàn)oxo3a、Wnt2、β-catenin的單克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

SW620細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，融合至90%后用0.25%胰蛋白酶消化傳代。傳代后的細(xì)胞接種在培養(yǎng)板內(nèi)并進(jìn)行分組，對(duì)照組用不含藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基處理，NC組轉(zhuǎn)染NC模擬物，miR-182組轉(zhuǎn)染miR-182模擬物。

1.3.2 miR-182表達(dá)的檢測(cè) 分組處理24 h后，用miRNA提取試劑盒分離細(xì)胞中的miRNA，用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。MiR-182的正向引物序列為：5′-ATGCTAGCATCGTACGTA-3′，反向引物序列為試劑盒內(nèi)的通用引物；U6的正向引物序列為：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列為：5′-TAGTAGCTAGCTAGCTAGCTGTAT-3′。反應(yīng)后軟件自動(dòng)生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值，以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-182的表達(dá)量。

1.3.3 細(xì)胞增殖活力的檢測(cè) 分組處理24 h后，取MTS試劑盒的20 μL檢測(cè)液加入培養(yǎng)孔內(nèi)，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后將培養(yǎng)板放置在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的吸光光度值。

1.3.4 細(xì)胞侵襲及遷移活力的檢測(cè) 分組處理時(shí)，在Transwell的上室內(nèi)預(yù)鋪基質(zhì)膠，細(xì)胞用不含血清的RMPI-1640培養(yǎng)基接種在Transwell的上室內(nèi)，下室內(nèi)加入含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基，分組處理24 h后取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)殘留的細(xì)胞，而后用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察隨機(jī)視野內(nèi)侵襲細(xì)胞的數(shù)目；另取分組處理時(shí)的細(xì)胞，直接將細(xì)胞接種在Transwell的上室內(nèi)，按照侵襲檢測(cè)的相同方法檢測(cè)遷移數(shù)目。

1.3.5 信號(hào)通路分子表達(dá)的檢測(cè) 分組處理24 h后，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白，4℃、12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min后收集蛋白上清，與上樣緩沖液混合后煮沸5 min，而后將樣本加入SDS-PAGE進(jìn)行電泳，電轉(zhuǎn)至NC膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃孵育1∶1 000稀釋的Foxo3a、Wnt2、β-catenin抗體或1∶5 000稀釋的β-actin抗體，過(guò)夜。次日，NC膜用1∶2 000稀釋的第二抗體室溫孵育2 h，最后用ECL顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件錄入數(shù)據(jù)，本研究計(jì)量資料均滿足正態(tài)性和方差齊性，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，癌組織與癌旁組織的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較使用方差分析，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌組織及癌旁組織中miR-182表達(dá)的比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-182表達(dá)量結(jié)果顯示，直腸癌組織中miR-182的表達(dá)量(2.14±0.55)明顯高于癌旁組織(1.06±0.24)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2 直腸癌細(xì)胞株及正常腸上皮細(xì)胞株中miR-182表達(dá)的比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，直腸癌細(xì)胞株HT29、SW620、HCT-116中miR-182的表達(dá)量分別為(1.77±0.34)、(2.31±0.61)、(1.61±0.32)，均明顯高于正常腸上皮細(xì)胞HIEC(1.05±0.26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且SW620細(xì)胞中miR-182表達(dá)增加最顯著，后續(xù)選擇SW620細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)(圖2)。

圖1 直腸癌組織及癌旁組織中miR-182的表達(dá)Figure 1 The expression of miR-182 in rectal cancer and adjacent tissuesNote：*P<0.05，when compared with adjacent tissues.

2.3 miR-182模擬物轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染miR-182模擬物后24 h，miR-182組SW620細(xì)胞中miR-182的表達(dá)量(2.41±0.52)明顯高于對(duì)照組(0.98±0.14)和NC組(1.02±0.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

2.4 miR-182模擬物轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞的增殖活力

MTS法檢測(cè)SW620細(xì)胞活力值OD490顯示，轉(zhuǎn)染miR-182模擬物后24 h，miR-182組SW620細(xì)胞的OD490值(194.35±18.15)%明顯高于對(duì)照組(100.0±14.94)%和NC組(102.34±18.34)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞中miR-182的表達(dá)水平Figure 3 The expression of miR-182 in SW620 cells transfected with miR-182 mimicsNotes：*P<0.05，when compared with the control group；#P<0.05，when compared with the NC group.

圖4 MTS法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的SW620細(xì)胞活力Figure 4 The viability of SW620 cells transfected with miR-182 mimicsNotes：*P<0.05，when compared with the control group；#P<0.05，when compared with the NC group.

2.5 miR-182模擬物轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞的侵襲活力

Transwell檢測(cè)SW620細(xì)胞侵襲活力顯示，轉(zhuǎn)染miR-182模擬物后24 h，miR-182組的遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯高于對(duì)照組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5，圖6)。

圖5 Transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的SW620細(xì)胞侵襲活力Figure 5 The invasive viability of SW620 cells transfected with miR-182 mimicsNotes：*P<0.05，when compared with the control group；#P<0.05，when compared with the NC group.

圖6 Transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的SW620細(xì)胞遷移活力Figure 6 The migrated viability of SW620 cells transfected with miR-182 mimicsNotes：*P<0.05，when compared with the control group；#P<0.05，when compared with the NC group.

2.6 miR-182模擬物轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞中Foxo3a/Wnt/β-catenin通路的表達(dá)

Western blot檢測(cè)SW620細(xì)胞中Foxo3a、Wnt2、β-catenin的表達(dá)量顯示，轉(zhuǎn)染miR-182模擬物后24 h，miR-182組SW620細(xì)胞中Foxo3a的蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組和NC組，Wnt2、β-catenin的蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1，圖7)。

表1 三組SW620細(xì)胞中Foxo3a、Wnt2、β-catenin表達(dá)量的比較

圖7 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SW620細(xì)胞中Foxo3a、Wnt2、β-catenin的表達(dá)量Figure 7 The expression of Foxo3a，Wnt2，and β-catenin proteins in SW620 cells transfected with miR-182 mimics

3 討論

我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，但疾病的早期診斷率仍較低，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)展至中晚期，盡管通過(guò)根治性手術(shù)、放化療、靶向治療等能夠取得一定療效，但中晚期結(jié)直腸癌患者的5年生存率較低整體預(yù)后并不理想。癌細(xì)胞增殖及侵襲所造成的病灶復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要因素，探究癌細(xì)胞增殖及侵襲的調(diào)控機(jī)制一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，miRNA與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系受到了廣泛關(guān)注，miRNA本身不具備編碼功能，其生物學(xué)作用的發(fā)揮依賴于在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。miRNA能夠靶向原癌基因或抑癌基因，當(dāng)miRNA的表達(dá)發(fā)生異常時(shí)，能夠引起相應(yīng)原癌基因或抑癌基因表達(dá)的變化，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-7]。

miR-182是具有促癌作用的miRNA，多項(xiàng)細(xì)胞研究證實(shí)，miR-182對(duì)乳腺癌、口腔癌等癌細(xì)胞的增殖、侵襲具有促進(jìn)作用[8-10]。另有研究報(bào)道，miR-182在結(jié)直腸癌中呈顯著高表達(dá)的趨勢(shì)，但關(guān)于miR-182對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染miR模擬物的方式來(lái)使直腸癌細(xì)胞中的miR-182發(fā)生過(guò)表達(dá)，在轉(zhuǎn)染24 h后，miR-182組細(xì)胞中miR-182的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-182的模擬物顯著增加了直腸癌細(xì)胞中miR-182的表達(dá)。在增加miR-182的表達(dá)后，分別通過(guò)MTS法和Transwell對(duì)細(xì)胞的增殖和遷移活力進(jìn)行了測(cè)定，研究結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-182的模擬物能夠使癌細(xì)胞的增殖活力和侵襲活力均增強(qiáng)，說(shuō)明miR-182對(duì)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲具有促進(jìn)作用，這也與miR-182在其他惡性腫瘤中的作用相一致。

Chen等[11]和Cao等[12]分別在肺癌和肝癌中研究了miR-182的靶基因。在肺癌中，miR-182能夠靶向Foxo3a并引起放療抵抗；在肝癌中，miR-182能夠靶向Foxo3a并促進(jìn)增殖和侵襲。Foxo3a是一類抑癌基因，能夠靶向抑制Wnt/β-catenin通路，阻斷Wnt/β-catenin對(duì)細(xì)胞周期蛋白、蛋白酶等的調(diào)控，進(jìn)而阻礙了細(xì)胞的增殖和侵襲[13-14]。在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)oxo3a的表達(dá)明顯減少且與β-catenin表達(dá)的增多具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示Foxo3a/Wnt/β-catenin通路在結(jié)直腸癌的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用[15]。本實(shí)驗(yàn)在轉(zhuǎn)染miR-182的模擬物后對(duì)細(xì)胞中該通路進(jìn)行了分析，miR-182的模擬物能夠使細(xì)胞中Foxo3a的表達(dá)減少、Wnt2及β-catenin的表達(dá)增加，說(shuō)明miR-182能夠靶向調(diào)節(jié)直腸癌細(xì)胞中的Foxo3a/Wnt/β-catenin通路，抑制Foxo3a的表達(dá)并使下游Wnt/β-catenin表達(dá)增多，進(jìn)而通過(guò)β-catenin的功能來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，miR-182能夠促進(jìn)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制可能與靶向Foxo3a/Wnt/β-catenin通路相關(guān)，未來(lái)miR-182可能成為直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。