仝 瀟 邢佳妮 王麗虹

乳腺癌的發(fā)病率位居我國女性惡性腫瘤之首，而占比10%～17%的三陰性乳腺癌(TNBC)更是由于缺乏治療靶點，而具有高侵襲性以及預后不良的特征[1]。因此，了解三陰性乳腺癌的發(fā)病機理，明確其疾病進展的相關機制對乳腺癌的預防和治療具有十分重要的意義。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸但卻沒有蛋白編碼能力的RNA轉錄本[2]。最新的證據(jù)表明，lncRNA參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[3-4]。HCP5是HLA和P5的復合物，主要在免疫系統(tǒng)細胞中表達，并在自身免疫中具有潛在作用[5]。最近的研究表明，HCP5在人類的一些癌癥中表達異常。HCP5是與HCV相關的肝細胞癌的易感性位點[6]，它也被認為是肺腺癌的潛在生物標志物[7]，但是在卵巢癌患者中卻顯著下調[8]。通過共表達網(wǎng)絡分析，我們發(fā)現(xiàn)HCP5與乳腺癌的預后息息相關[9]。然而，HCP5在TNBC中的作用機制尚未明確。本研究通過探討HCP5在TNBC中的表達、功能和調控機制，為尋找新的TNBC治療靶點提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和臨床組織樣本

實驗所需的人乳腺癌細胞系(MCF-7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453)和人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A均由中國科學院上海生物科學研究所提供。MCF-10A細胞系在F12/DMEM 1∶1的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。MCF-7細胞系在按比例加入0.01 mg/mL牛胰島素和0.11 mg/mL丙酮酸鈉的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。T47D和SK-BR-3細胞系使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。以上所有細胞系均使用10%胎牛血清(FBS)在37℃和5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。而MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-453細胞系則使用含10%胎牛血清(FBS)的L-15培養(yǎng)基，在37℃、無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗所需的臨床組織樣本為2014—2015年哈爾濱醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院提供，其中包括30例浸潤性導管癌(7例三陰、11例luminal A型、8例luminal B型和4例Her2+型)和30例浸潤性導管癌的癌旁正常乳腺組織。上述所有組織的提供者在術前均未接受過放療、化療及免疫治療，亦未合并其他惡性腫瘤。實驗方案也獲得了哈爾濱醫(yī)科大學人類研究倫理委員會的批準。

1.2 基因敲除和慢病毒轉染

將MDA-MB-231(1×105)和MDA-MB-468(2×105)細胞分別接種在6孔板中，24 h后使用Lipofectamine 2000試劑轉染50 nM的siRNA。將含有細胞的6孔板按照濃度梯度分別加入適量的慢病毒后再加入1/1 000的聚丁二烯增強轉染效果。HCP5 siRNA的序列為5′-GCAGTGTGCTTCCTTCCTT-3′。陰性對照組(NC)siRNA序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.3 細胞RNA提取和熒光定量PCR

熒光定量PCR檢測人乳腺癌細胞系(MCF-7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-453)和人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A中HCP5 mRNA的相對表達。首先使用TRIzol試劑提取細胞總RNA。提取出來的RNA用核酸測量儀測量其濃度，其次利用ReverTra Ace-α qPCR RT試劑盒對RNA進行逆轉錄，合成cDNA。采用miRcute第一鏈cDNA合成試劑盒對成熟的miRNA進行RT-PCR檢測。然后根據(jù)SYBR?Green RT-PCR試劑盒操作，在ABI 7500儀器上進行qRT-PCR擴增。以GAPDH為內參基因，所有樣品進行3次獨立重復性試驗。本研究引物序列如下：HCP5-F：5′-GACTCTCCTACTGGTGCTTGGT-3′，HCP5-R：5′-CACTGCCTGGTGAGCCTGTT-3′；GAPDH-F：5′-CGTCACGGATTIGGTCG-3′，GAPDH-R：5′-TCICGCTCCIGAGGGGGAT-3′。最后用比較值2-△△CT法對qRT-PCR結果進行分析。

1.4 RNA Scope實驗

乳腺癌組織芯片北京中山金橋公司代為檢測。制備1×清洗緩沖液、復染試劑、脫水試劑，平衡試劑。在組織芯片上滴加探針，40℃以下雜交爐中2 h；用1×清洗緩沖液在室溫下清洗玻片2次，每次2 min；加入約4滴Amp 1，40℃以下雜交爐中30 min，用1×清洗緩沖液清洗，方法同上；加入約4滴Amp 1，40℃以下雜交爐中30 min，用1×清洗緩沖液在室溫下清洗玻片2次，每次2 min；加入約4滴Amp 2，40℃以下雜交爐中15 min，清洗同上；加入約4滴Amp 3，40℃以下雜交爐中30 min，清洗同上；加入約4滴Amp 4，40℃以下雜交爐中15 min，清洗同上；加入約4滴Amp 5，室溫孵育中30 min，清洗同上；加入約4滴Amp 6，室溫孵育中15 min，清洗同上；DAB染色室溫10 min，蒸餾水清洗兩次；50%蘇木精染色室溫2 min，蒸餾水清洗玻片3～5次；載玻片脫水，70% EtOH處理2 min，100% EtOH處理2 min，第二次100% EtOH處理2 min。二甲苯處理5 min；固定樣品，向每個載玻片上滴加1～2滴Cytoseal，蓋玻片蓋好，風干載玻片。使用標準亮視野顯微鏡放大20～40倍觀察組織切片，評估陽性對照強度和陰性對照背景。

1.5 細胞生存與毒性試驗

使用Calcein-AM和ethidium homodimer(EthD-1)雙染法檢測活細胞和死細胞。將轉染了HCP5 siRNA和對照siRNA的MDA-MB-231、MDA-MB-468細胞分別置于96孔板中，去除培養(yǎng)基，用PBS輕柔洗滌細胞2次。并根據(jù)實驗方案制備分析試劑，在96孔板的每個孔中分別加入150 μL 的分析試劑。然后將96孔板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。用BERTHOLD的LB 942 TriStar2進行檢測。用530 nm激發(fā)濾光片觀察到綠色的是活細胞，用645 nm激發(fā)濾光片觀察到紅色的為死細胞。最后根據(jù)說明說中的公式計算活細胞和死細胞的百分率。活細胞百分率=(F(530)sam-F(530)min/F(530)max-F(530)min)×100%；死細胞百分率=(F(645)sam-F(645)min/F(645)max-F(645)min)×100%。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖

將轉染了HCP5 siRNA和對照siRNA的MDA-MB-231、MDA-MB-468細胞分別置于96孔板中，在37℃培養(yǎng)箱中分別孵育4 h、24 h、48 h、72 h后，在每孔中加入10 μL的CCK-8試劑。再置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的OD值，并繪制細胞生長曲線，所有的實驗重復3次。

1.7 裸鼠體內實驗

將穩(wěn)定表達LV10-sh-NC或LV10-sh-HCP5的MDA-MB-231細胞(8×106)和MDA-MB-468細胞(1×107)的細胞皮下注射到4周齡雌性BALBc裸鼠的背部皮下(每組6只)。每5天測量一次小鼠的腫瘤體積。30天后處死裸鼠，切除腫瘤組織，稱量瘤體重量，并用4%的多聚甲醛溶液固定。

1.8 抗體芯片

用轉染了HCP5 siRNA和對照siRNA的MDA-MB-231細胞進行抗體芯片檢測。選擇RayBio C-Series人MAPK通路檢測試劑盒(AAH-MAPK-1)和凋亡檢測試劑盒(AAH-APO-1-2)，由RayBio公司提供檢測分析。首先將膜與生物素化檢測抗體混合物的孵育阻斷，然后再用HRP-偶聯(lián)的鏈霉親和素和檢測緩沖液進行孵育。緊接著利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)檢測圖像。最后，進行密度測定和分析。該實驗重復三次取其平均值。

1.9 蛋白印跡實驗

從轉染了HCP5 siRNA和對照siRNA的MDA-MB-231、MDA-MB-468細胞中提取蛋白進行Western blot檢測。用冷RIPA緩沖液與1% PMSF混合物裂解細胞，4℃，12 000×g離心30 min。根據(jù)說明書使用BCA蛋白檢測試劑盒測定樣品的濃度。然后通過SDS-PAGE技術將每孔中等量的總蛋白電轉移到PVDF膜上。再在搖床上用5%的BSA室溫封閉膜1 h，TBST洗膜(3次/10 min)。洗好的膜用一抗(抗BIRC3抗體1∶500，抗Caspase-3抗體1∶500，抗β-actin 1∶2 500)孵育，4℃過夜。次日用TBST洗膜(3次/10 min)，洗好的膜在室溫下加入相應的二抗(1∶10 000)孵育1 h。再用TBST洗膜3次，在膜上均勻加入超敏化學發(fā)光液(ECL)，用SageCaptureTM微型檢測系統(tǒng)檢測并采用Lanc ID分析軟件計算相對密度值。

1.10 統(tǒng)計分析

運用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，TNBC細胞系與正常乳腺上皮細胞系及非TNBC細胞系多組間計量資料的比較，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，細胞增殖實驗用重復測量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCP5在TNBC細胞系和臨床樣本中的表達

與正常乳腺上皮細胞系MCF-10A和其他非TNBC細胞系MCF-7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-453相比，MDA MB-231和MDA-MB-468這兩種TNBC細胞系中的HCP5 mRNA表達量明顯升高(P<0.05)(圖1A)。與30例浸潤性導管癌癌旁正常組織以及其他亞型乳腺癌組織相比，HCP5 mRNA在TNBC中表達上調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1B)。為了驗證我們的結果，我們從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫下載了含有1 095個臨床浸潤性乳腺癌樣本和113個非腫瘤乳腺組織數(shù)據(jù)，其中包含115個TNBC樣本。與非腫瘤乳腺組織以及TCGA數(shù)據(jù)集中的其他分子亞型相比，HCP5在基底樣乳腺癌中的表達量上調(P<0.01)，但是HCP5的表達量在正常乳腺與未分型的乳腺癌兩組中無統(tǒng)計學差異(圖1C)。

2.2 敲低HCP5對TNBC細胞凋亡和增殖的影響

CCK-8結果顯示，轉染24 h后，與對照組MDA-MB-231 siNC和MDA-MB-468 siNC相比，MDA-MB-231 siHCP5和MDA-MB-468 siHCP5組細胞增殖明顯受到抑制(P<0.01)(圖2A)。細胞存活/死亡實驗結果表明，與對照組MDA-MB-231 siNC和MDA-MB-468 siNC相比，MDA-MB-231 siHCP5和MDA-MB-468 siHCP5組的細胞凋亡增加(P<0.01)(圖2B)。

2.3 敲低HCP5對TNBC細胞體內成瘤能力的影響

用慢病毒轉染的方法建立MDA-MB-231和MDA-MB-468的HCP5敲低穩(wěn)轉細胞系(MDA-MB-231-shNC、MDA-MB-231-shHCP5和MDA-MB-468-shNC、MDA-MB-468-shHCP5)，分別接種于裸鼠背部皮下。結果顯示，與MDA-MB-231-shNC和MDA-MB-468-shNC相比，MDA-MB-231-shHCP5和MDA-MB-468-shHCP5組腫瘤生長緩慢，腫瘤的重量明顯降低(P<0.01)(圖3A，C)，腫瘤的體積也明顯減小(P<0.01)(圖3B，D)。

2.4 HCP5調控TNBC進展的途徑

采用抗體芯片技術檢測了敲低HCP5的MDA-MB-231細胞系和對照細胞系中MAPK通路和凋亡通路蛋白的表達。結果顯示，MAPK通路中兩組細胞系之間蛋白表達差異沒有統(tǒng)計學意義(圖4A)；而凋亡通路檢測結果發(fā)現(xiàn)，HCP5穩(wěn)定敲低的細胞中，凋亡抑制因子BIRC3的表達顯著降低，Caspase-3的表達增加(P<0.05)(圖4B)。Western blot檢測的結果也顯示了相同的趨勢：在兩組細胞中，敲低HCP5的細胞BIRC3表達量下降，其下游因子Caspase-3表達量增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4C)。

圖1 HCP5在乳腺癌細胞和組織中的表達Figure 1 The expression of HCP5 in breast cancer cells and breast cancer tissuesNote：A.The expression of HCP5 was higher in TNBC cell lines than that in normal breast epithelial cell line MCF-10A and other breast cancer cell lines.*P<0.05，when compared with other cell lines；B.The RNA Scope detection showed that the expression of HCP5 was significantly up-regulated in TNBC tissues than that in adjacent normal tissues and other breast cancer subtype tissues(400×)；C.The expression of HCP5 was higher in basal-like breast cancers than that in normal breast tissues and other subtypes from the TCGA database.

圖2 敲低HCP5對TNBC細胞凋亡和增殖的影響Figure 2 Effect of knockdown HCP5 on apoptosis and proliferation of TNBC cellsNote：A.The CCK-8 assay was performed to measure the proliferation of MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells.*P<0.05，**P<0.01；B.Knockdown HCP5 promoted apoptosis of MDA-MB-231 cells and MDA-MB-468 cells as shown by Calcein-AM/EthD-1 staining.Green：live cells，Red：dead or dying cell(400×).

圖3 敲低HCP5對TNBC細胞體內成瘤能力的影響Figure 3 Effects of knockdown HCP5 on orthotopic tumor in nude miceNote：A.The representation picture and tumor weight of tumor formation of xenograft from lv10-sh-control and lv10-sh-HCP5 MDA-MB-231 cells in nude mice(n=6)；B.The summary for tumor volume was measured in nude mice every 5 days；C.The representation picture and tumor weight of tumor formation of xenograft in nude mice(n=6)；D.The summary for tumor volume was measured in mice every 5 days.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the control group.

圖4 HCP5調控TNBC進展的途徑Figure 4 The mechanisms of HCP5 in the regulation of TNBC cellsNote：A.The MAPK antibody array showed no difference between wild and HCP5 knockdown MDA-MB-231 cells；B.The representative picture of APO antibody array showed an obviously decreased expression of BIRC3 and increased expression of caspase-3 in HCP5 knockdown MDA-MB-231 cells(n=3)；C.HCP5 knockdown decreased the expression of BIRC3 protein and increased the expression of Caspase-3 protein in MDA-MB-231 and MDA-MB-468 cells.*P<0.05，when compared with the control group.

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，嚴重危害患者的身心健康[10]。同時在世界上大部分地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均居當?shù)貗D女惡性腫瘤之首。而TNBC作為乳腺癌惡性程度最高的亞型，由于其致病機制的復雜性，缺乏有效的治療靶點，因此一直沒有較好的治療措施。

lncRNA是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中必不可少的調節(jié)因子[11-12]，在肝細胞癌、卵巢癌、肺腺癌等許多癌癥中人們發(fā)現(xiàn)了lncRNA HCP5的異常表達。然而，HCP5在乳腺癌中的作用機制尚不明確。

本研究用qPCR和RNA Scope方法檢測了乳腺癌細胞系和臨床樣本中HCP5的表達量，發(fā)現(xiàn)HCP5在TNBC細胞系和臨床樣本中的表達量顯著升高。為了進一步了解HCP5在TNBC中的作用機制，我們敲低了內源性HCP5，發(fā)現(xiàn)敲低HCP5可以增加TNBC細胞的凋亡，抑制細胞的增殖和裸鼠體內腫瘤的生長。因此，我們推測HCP5在TNBC中的表達上調可能促進了腫瘤的惡性進展。于是，我們通過抗體芯片對調控細胞增殖的MAPK通路和凋亡通路的蛋白進行檢測，并用Western blot進行驗證，我們發(fā)現(xiàn)當敲低HCP5時，MAPK通路蛋白表達沒有顯著差異，但凋亡通路中的凋亡抑制因子BIRC3表達量下降，而其下游凋亡因子Caspase-3表達量增加，說明細胞的凋亡過程與TNBC的進展密切相關。已知BIRC3是一種典型的細胞凋亡抑制劑，它通過抑制細胞凋亡來促進癌細胞的存活，是許多癌癥的潛在致癌基因[13-14]。由此我們推測HCP5通過抑制腫瘤細胞凋亡促進TNBC惡性進展，但其調控BIRC3及Caspase-3的確切機制尚有待進一步研究。

綜上所述，lncRNA HCP5在TNBC中顯著上調，并通過調控細胞凋亡通路促進TNBC的惡性進展。此外，我們的研究強調了HCP5的作用，并證明靶向HCP5可能是TNBC患者的一種有前途的治療策略。然而，HCP5能否作為治療TNBC的分子靶點尚需進一步臨床驗證。