舒慧珍,唐志凌,韓 薇,陳海明,陳衛(wèi)軍,胡月英,陳文學,

（1.海南大學食品科學與工程學院,海南 海口 570228；2.海南大學材料與化工學院,海南 海口 570228）

近年來,食品安全面臨的主要問題包括由腐敗菌和致病菌引起的食源性疾病,它們對公眾健康構(gòu)成嚴重威脅[1]。隨著消費模式的改變,冷鮮肉成為肉類消費的主流,冷鮮肉的質(zhì)量安全也成為不容忽視的問題。微生物對肉類的污染不僅對生產(chǎn)者和消費者造成經(jīng)濟損失,而且對人體健康構(gòu)成嚴重的影響。冷鮮肉中常發(fā)現(xiàn)的腐敗性嗜冷菌有假單胞菌屬、莫拉氏菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬、腸肝菌屬、乳桿菌屬、熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）等[2]。腐敗變質(zhì)的食品對人體有很大危害,微生物代謝的產(chǎn)物不僅能導致人的過敏、中毒,還可通過消化道或呼吸道進入人體,誘發(fā)某些病變[3]。

熱殺索絲菌是一種革蘭氏陽性好氧和兼性厭氧型長桿菌,生長的溫度一般在0～30 ℃,可在冷凍肉類和海產(chǎn)品中產(chǎn)生異味并導致變質(zhì)。Jiang Yun等[4]的研究表明熱殺索絲菌是導致真空包裝冷卻豬肉4 ℃貯藏末期中腐敗的優(yōu)勢菌之一。Reid等[5]研究發(fā)現(xiàn)熱殺索絲菌是真空包裝牛肉中主要的嗜冷菌之一。Silbande等[6]研究認為熱殺索絲菌是金槍魚冰貯過程中的主要腐敗菌,因其兼性厭氧和嗜冷的特點,即便在真空低溫的條件下,也能利用食品中的營養(yǎng)成分產(chǎn)生腐敗物質(zhì),導致肉品腐敗和變質(zhì)[7]。幾十年來,人們制定各種策略來防止食品中致病菌和腐敗細菌的生長,以達到保藏食品的目的,在食品工業(yè)中最常用、簡便和高效的方法是向食品中加入化學防腐劑。但化學防腐劑的潛在毒性、微生物耐藥性、安全、殘留等問題日益突出。天然防腐劑由于其抗菌性強、水溶性好、安全無毒、抑菌譜廣等優(yōu)點使得人們越發(fā)關注其開發(fā)與研究[8]。

植物精油是一種有效的天然防腐劑,通常從香料和草藥中提取,具有良好的感官和防腐性能,可以抑制微生物生長,延長貨架期[9]。單萜化合物是植物精油的主要成分,具有抗菌等多種生物活性。百里酚、薄荷醇、亞麻酸乙酯是3 種單萜化合物,通過破壞細胞壁和細胞膜,導致細胞內(nèi)物質(zhì)滲漏,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有有效的抗菌活性[10]。β-石竹烯,又稱β-丁香油精,一種雙環(huán)倍半萜型的天然產(chǎn)物,其性狀為無色至微黃油狀液體,具有淡的丁香似香味[11]。國家標準化管理委員會規(guī)定石竹烯可用作食用香料（GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》）。石竹烯廣泛存在于一些天然植物中,如作為海南黑、白胡椒的主要香氣成分,石竹烯的相對含量分別為44.41%和12.98%[12]。牡荊揮發(fā)油的主要成分為石竹烯（43.12%）,對大腸桿菌、枯草桿菌、四聯(lián)球菌均表現(xiàn)出較強的抑菌效果[13]。但是,目前還鮮有石竹烯對B.thermosphacta的抑菌性能和抑制機制的相關報道。

本實驗通過測定最小抑菌濃度（minimum inhibition concentration,MIC）和生長曲線等指標確定石竹烯對B.thermosphacta的抑菌活性,并通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy,SEM）觀察、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）活力測定、二乙酸熒光素（fluorescein diacetate,FDA）染色實驗、胞外鉀離子濃度、細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)含量、丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）、蘋果酸脫氫酶（malic dehydrogenase,MDH）活力和基因組DNA相對含量的測定等進一步探究石竹烯對B.thermosphacta的抑菌機理,為石竹烯作為天然抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B.thermosphacta廣東微生物菌種保藏中心；β-石竹烯（純度＞90%） 日本TCL公司；營養(yǎng)肉湯、瓊脂、無水乙醇、無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）、FDA、G250考馬斯亮藍 北京索萊寶科技有限公司；AKP活性測定試劑盒、MDH活性測定試劑盒、PK活性測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

GI54DS型高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；SW-CJ-1FD型無菌超凈工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；SPX-288型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SHA-2型恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；CR22N型落地式高速冷凍離心機、S-3000型掃描電子顯微鏡日本日立公司；TU1810型紫外-可見分光光度計、TAS-990 Super AFG型原子吸收分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Alpha1型冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；JYD-650L型超聲波細胞粉碎機 上海五相儀器儀表有限公司；WGY-10型熒光分光光度計 天津港東科技發(fā)展股份有限公司；NanoPhotometer-N50型超微量分光光度計 德國Implen公司；SP-Max3500FL型多功能酶標儀 上海閃譜生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將B.thermosphacta接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h進行傳代以恢復活性?；罨蟮腂.thermosphacta接種到滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,26 ℃培養(yǎng)18～24 h,使用麥氏比濁法用生理鹽水將菌液濃度稀釋至106～107CFU/mL備用。

1.3.2 MIC的測定

采用瓊脂稀釋法[14]測定MIC。將溶于20%（體積分數(shù),下同）乙醇溶液的石竹烯2 倍梯度稀釋,得到不同質(zhì)量濃度石竹烯溶液,并與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均勻混合,使瓊脂培養(yǎng)基中石竹烯終質(zhì)量濃度分別為18.04、9.02、4.51、2.26、1.13、0.56 mg/mL,以加入等量無菌水和20%乙醇溶液的培養(yǎng)基分別為空白、陰性對照組。將200 μL稀釋至106～107CFU/mL的菌懸液均勻地涂布于平板上,26 ℃倒置培養(yǎng)24 h。觀察各平板菌落生長情況,以肉眼看不見細菌生長的最小稀釋濃度為MIC。

1.3.3 生長曲線的測定

通過紫外-可見分光光度法測定B.thermosphacta的生長曲線[15]。取對數(shù)生長期的B.thermosphacta濃度梯度稀釋為106～107CFU/mL,并按體積分數(shù)5%的接種量接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,以加入1 倍和2 倍最小抑菌濃度（1×MIC、2×MIC）的石竹烯的組為實驗組,以加入等量無菌水和20%乙醇溶液的培養(yǎng)基分別為空白、陰性對照組,在搖床中培養(yǎng),每隔1 h用紫外-可見分光光度計在600 nm處測定樣品OD值。

1.3.4 細胞形態(tài)的觀察

根據(jù)Diao Wenrui等[16]的方法,采用掃描電子顯微鏡觀察B.thermosphacta細胞外部形態(tài)的變化。向培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌懸液中加入1×MIC、2×MIC石竹烯的組為實驗組,加入等量無菌水和20%乙醇溶液的組分別為空白、陰性對照組,分別取培養(yǎng)4、8 h的菌懸液,低溫離心收集菌體。用PBS（pH 7.2）洗滌3 次,再用乙醇逐級脫水,將脫水后的菌體置于-20 ℃預冷凍2 h,冷凍干燥12 h后取樣鍍金,在掃描電子顯微鏡上觀察細胞形態(tài)。

1.3.5 AKP活力的測定

通過測定AKP活力來評價石竹烯對B.thermosphacta細胞壁的破壞程度。實驗組和對照組的配制如1.3.4節(jié),將培養(yǎng)至0、3、6、9、12 h的菌液離心后取上清液,按照AKP試劑盒說明書測定上清液AKP活力。

1.3.6 FDA染色實驗

通過FDA熒光強度的測定來反映細菌細胞膜的完整性和通透性。根據(jù)曾哲靈等[17]的方法做適當調(diào)整。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的B.thermosphacta6 000 r/min低溫離心收集菌體并重懸于無菌生理鹽水中,實驗組和對照組的配制如1.3.4節(jié)。在培養(yǎng)至6、9、12 h分別取樣離心收集菌體,用PBS洗滌2 次后與250 μL FDA-丙酮溶液（2 mg/mL）在常溫下共同孵育20 min,加入PBS洗滌,低溫離心,棄去上清液,重復3 次后,再將菌體重懸于PBS中,用熒光分光光度計測定樣品的平均熒光強度。

1.3.7 細胞外鉀離子質(zhì)量濃度的測定

測定細菌細胞中鉀離子的外流是研究抗菌藥物對細胞膜損傷的經(jīng)典方法。通過鉀離子釋放實驗進一步探討石竹烯對B.thermosphacta細胞壁和膜的影響。參考Miao Jianyin等[18]的方法并做適當調(diào)整。低溫離心培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體,用生理鹽水（0.9%光譜純NaCl、超純水稀釋）將收集到的菌體洗滌3 次并重懸于等量生理鹽水中,對照組和實驗組的配制如1.3.4節(jié),在0、0.5、1、2、3、4 h分別取樣,10 000 r/min離心取上清液,并用超純水稀釋至適當濃度,使用原子吸收分光光度計測定。

1.3.8 細胞外蛋白質(zhì)量濃度的測定

通過測定細胞外蛋白質(zhì)量濃度來判斷石竹烯對B.thermosphacta蛋白質(zhì)泄漏情況的影響。實驗組和對照組的配制如1.3.4節(jié)。分別取培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h的菌懸液低溫離心,取上清液,采用考馬斯亮藍法,用紫外-可見分光光度計于595 nm波長處測定吸光度。

1.3.9 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度的測定

通過測定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度來研究石竹烯對B.thermosphacta蛋白質(zhì)合成的影響以及為后續(xù)MDH活力的測定提供計算基礎。參考He Mengying等[19]的方法。實驗組和對照組的配制如1.3.4節(jié),用PBS將低溫離心收集到的培養(yǎng)至0、3、6、9、12、24 h的菌體洗滌3 次并重懸。上機破碎細胞5 min,10 000 r/min離心10 min,取上清液冷藏于4 ℃。采用考馬斯亮藍法,用紫外-可見分光光度計于595 nm波長處測定吸光度。

1.3.10 MDH活力的測定

通過MDH活力的變化來研究石竹烯對B.thermosphacta糖代謝和三羧酸循環(huán)等的影響。采用MDH試劑盒測定的方法,將工作液37 ℃預溫,取100 μL 1.3.9節(jié)中超聲破碎后的樣液,再加入1 mL工作液,混合均勻后,開始計時,在20、80 s時記錄吸光度分別為A1、A2。計算2 次吸光度差（ΔA＝A1-A2）,按公式（1）計算MDH活力。

式中：微摩爾消光系數(shù)為6.2 L/（μmol·cm）；測定ΔA為20 s時測定管的吸光度與80 s時的測定管吸光度的差值；空白ΔA為20 s時空白管的吸光度與80 s時的空白管吸光度的差值；比色皿半徑為0.5 cm；反應液總體積為1.1 mL；取樣量為0.1 mL；待測樣本蛋白質(zhì)量濃度單位為mg/mL。

1.3.11 PK活力的測定

通過PK活力的變化研究石竹烯對B.thermosphacta糖酵解等代謝途徑的影響。采用PK試劑盒測定的方法。將在37 ℃預溫的試劑與100 μL 1.3.9節(jié)中超聲破碎后的樣液混合均勻,計時、進行比色,在0.5、15.5 min時記錄吸光度分別為A1、A2,第一次記錄后要將反應液倒入原試管中,將試管水浴15 min,再上機記錄第二次,計算2 次吸光度差（ΔA＝A1－A2）,按公式（2）計算PK活力。

式中：ΔA為30 s時測定管的吸光度與15 min 30 s時測定管吸光度的差值；毫摩爾消光系數(shù)為6.22 L/（mmol·cm）；反應時間為15 min；比色皿半徑為0.5 cm；反應液總體積為1.195 mL；取樣量為0.02 mL。

1.3.12 細菌基因組DNA相對含量的測定

用熒光光譜法研究石竹烯與B.thermosphactaDNA的相互作用。按照試劑盒說明書的方法提取B.thermosphacta細菌基因DNA。提取的DNA的純度和濃度用超微量分光光度計分別通過260 nm和280 nm波長處的光密度值比（OD260nm/OD280nm＝1.8）和OD260nm確定[20]。用0.01 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）緩沖液將細菌基因組DNA稀釋至60 μg/mL。將不同質(zhì)量濃度的石竹烯溶液（0、1×MIC、2×MIC、4×MIC）加入到相同體積的DNA溶液中,并在37 ℃在黑暗中溫育10 min。采用多功能酶標儀在激發(fā)波長280 nm處,測量混合物從300 nm到500 nm的熒光光譜,狹縫寬度為10 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析,P＜0.05表示存在顯著性差異,使用Origin 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 石竹烯對B.thermosphacta的MIC

表1 B.thermosphacta生長情況Table 1 Growth of B.thermosphacta

由表1可知,石竹烯對B.thermosphacta有較好的抑菌效果,且抑菌能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增加,當石竹烯質(zhì)量濃度為4.51 mg/mL時細菌不能生長,即石竹烯對B.thermosphacta的MIC為4.51 mg/mL,且20%乙醇溶液對B.thermosphacta的生長沒有影響。

2.2 石竹烯對B.thermosphacta生長的影響

在一定的波長范圍內(nèi),菌懸液濃度與吸光度成正比[21],可通過OD值變化來評判石竹烯對B.thermosphacta的抑制和殺滅作用。如圖1所示,空白對照組和陰性對照組呈現(xiàn)典型細菌生長特點的S型生長曲線。在10～18 h期間,兩組的細菌迅速生長,乙醇組相較于空白組略緩慢,但最終幾乎同時達到穩(wěn)定期,這表示20%乙醇溶液對細菌的生長影響甚微。在加入終質(zhì)量濃度為1×MIC和2×MIC石竹烯的菌液中,菌液OD600nm顯著低于對照組（P＜0.05）,細菌幾乎停止生長。結(jié)果表明在接種體積分數(shù)5%的106～107CFU/mLB.thermosphacta后加入終質(zhì)量濃度為1×MIC和2×MIC的石竹烯能夠有效抑制B.thermosphacta的生長。

圖1 石竹烯對B.thermosphacta生長的影響Fig.1 Effect of caryophyllene on the growth of B.thermosphacta

2.3 石竹烯對B.thermosphacta細胞形態(tài)的影響

圖2 B.thermosphacta掃描電子顯微鏡圖（8 000×）Fig.2 Scanning electron microphotographs of B.thermosphacta (8 000 ×)

如圖2所示,空白組（圖2A1、A2）中的菌體呈正常短桿狀,圓潤飽滿、表面光滑、邊緣整齊、形狀規(guī)則、粗細均勻一致,未出現(xiàn)細胞破裂、內(nèi)容物溢出等現(xiàn)象。陰性對照組（圖2B1、B2）中B.thermosphacta經(jīng)乙醇處理4、8 h后細胞表面有輕微的褶皺,受到的破壞很小,大部分菌體完好,可見20%乙醇溶液對B.thermosphacta的影響甚微。經(jīng)石竹烯作用4 h的B.thermosphacta（圖2C1、D1）,能觀察到菌體表面粗糙,出現(xiàn)褶皺,在細胞周圍觀察到許多細胞碎片,部分菌體分裂,從而引起細胞內(nèi)容物的外泄。經(jīng)石竹烯處理8 h的B.thermosphacta（圖2C2、D2）形態(tài)受到破壞,菌體萎陷,邊緣模糊,細胞表面粗糙不平并出現(xiàn)孔洞,細胞內(nèi)容物外泄。由此可見,石竹烯能破壞B.thermosphacta的完整性,使細胞內(nèi)容物泄漏。

2.4 石竹烯對B.thermosphacta細胞壁通透性的影響

在細胞正常情況下,不能在胞外檢測到AKP活力,當細胞壁受到一定破壞時,其通透性增加,存在于細胞壁和細胞膜之間的AKP容易泄漏到細胞外,因此通過檢測胞外AKP活力的變化,可反映細菌細胞壁受損壞的情況[22]。由圖3可知,在1×MIC、2×MIC石竹烯作用的菌液中AKP活力極顯著大于對照組中AKP活力（P＜0.01）。隨著時間的延長,檢測到空白對照組和陰性對照組細胞外AKP含量變化很小,而實驗組在經(jīng)石竹烯處理2 h后開始出現(xiàn)AKP的大量滲出,而且添加2×MIC石竹烯的菌液中檢測到的AKP泄漏量明顯高于1×MIC。0～8 h內(nèi),1×MIC石竹烯作用的菌液中AKP活力穩(wěn)定上升,2×MIC石竹烯作用的菌液中AKP活力波動較大,但仍呈上升的趨勢。結(jié)果表明石竹烯能通過誘導細胞壁損傷而作用于細胞壁,增加細胞壁的通透性,導致大量AKP外泄到胞外。

圖3 石竹烯對B.thermosphacta細胞外AKP活力的影響Fig.3 Effect of caryophyllene on the activity of extracellular AKP in B.thermosphacta

2.5 石竹烯對B.thermosphacta細胞膜通透性的影響

圖4 石竹烯對B.thermosphacta 細胞膜通透性的影響Fig.4 Effect of caryophyllene on cell membrane permeability of B.thermosphacta

研究表明大多數(shù)抑菌物質(zhì)都作用于細胞膜,細胞膜能夠維持細胞內(nèi)物質(zhì)和能量的平衡,使細胞維持正常的生命活動[23]。FDA進入細胞后可被酶水解為在細胞中發(fā)出黃綠色熒光的熒光素,若細胞膜受到破壞,熒光素分子會流到細胞外,導致FDA熒光強度降低[24]。FDA熒光強度低表明細胞內(nèi)細胞膜完整性被破壞,熒光從胞漿中外漏。由圖4可知,由于細菌增長繁殖,隨著時間的延長細胞內(nèi)滯留的熒光素分子含量增加,空白組和陰性對照組的熒光強度顯著增加,顯著高于1×MIC組和2×MIC組（P＜0.05）。經(jīng)1×MIC石竹烯處理的菌液熒光強度在6～12 h內(nèi)增長緩慢,經(jīng)2×MIC石竹烯作用的菌液熒光強度在6～9 h期間緩慢增長,直至12 h略有下降。說明石竹烯能破壞細胞膜結(jié)構(gòu)、增強細胞膜通透性、導致FDA外泄,并隨著石竹烯質(zhì)量濃度從1×MIC增加至2×MIC,隨著作用時間的延長,破壞程度更為明顯。

2.6 石竹烯對B.thermosphacta細胞外鉀離子質(zhì)量濃度的影響

當微生物細胞膜被破壞,其通透性變化,則會導致一些電解質(zhì)泄漏,如鉀離子[25]。由圖5可知,空白組和陰性對照組中,胞外鉀離子的質(zhì)量濃度幾乎沒有增長,且在各個時間段內(nèi)極顯著低于用石竹烯處理的菌液中的鉀離子質(zhì)量濃度（P＜0.01）。1×MIC、2×MIC石竹烯作用的菌液中,胞外鉀離子濃度顯著增大（P＜0.05）,在0～0.5 h,鉀離子質(zhì)量濃度迅速增加。細胞外鉀離子的存在表明鉀離子從細菌細胞中泄漏,且在處理0.5 h內(nèi)鉀離子出現(xiàn)大量泄漏,這是由于石竹烯破壞B.thermosphacta的細胞膜結(jié)構(gòu),細胞膜通透性增加,從而導致鉀離子等細胞原生質(zhì)內(nèi)容物的泄漏。經(jīng)石竹烯處理后細胞內(nèi)鉀離子流出量的增加為石竹烯對細菌膜損傷機制提供了更多的依據(jù)。

圖5 石竹烯對B.thermosphacta細胞外鉀離子質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of caryophyllene on extracellular potassium ion concentration in B.thermosphacta

2.7 石竹烯對B.thermosphacta細胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響

圖6 石竹烯對B.thermosphacta細胞外蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of caryophyllene on extracellular protein concentration in B.thermosphacta

由圖6可知,空白組和陰性對照組中胞外蛋白質(zhì)量濃度雖有一定程度的波動但最終趨于平穩(wěn),且低于用石竹烯處理后的B.thermosphacta懸液中的胞外蛋白質(zhì)量濃度,說明石竹烯損傷細胞,破壞細胞的完整性,導致胞內(nèi)蛋白質(zhì)大量外泄。1×MIC石竹烯溶液作用的菌液中胞外蛋白質(zhì)量濃度顯著增加（P＜0.05）,在0～4 h內(nèi),迅速增加,4 h后有輕微波動。2×MIC石竹烯溶液作用的菌液中胞外蛋白質(zhì)量濃度低于1×MIC石竹烯溶液作用后的菌液且滲出速率緩慢,可能是因為菌體受到高質(zhì)量濃度石竹烯的作用,其自我修復功能受到激發(fā)[26],少數(shù)菌體恢復活力,繼續(xù)生存繁殖,菌液中的蛋白質(zhì)被正在生長的菌體所消耗,蛋白質(zhì)滲出胞外的速率也相對小于1×MIC石竹烯作用的菌液中的滲出速率。

2.8 石竹烯對B.thermosphacta細胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度的影響

圖7 石竹烯對B.thermosphacta細胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.7 Effect of caryophyllene on intracellular protein concentration in B.thermosphacta

由圖7可知,空白組和陰性對照組中,隨著生長時間的延長,B.thermosphacta大量繁殖,代謝旺盛,細胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度呈增加的趨勢,經(jīng)石竹烯作用的菌液中蛋白質(zhì)量濃度小于對照組。1×MIC石竹烯作用的菌液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度波動較大,但總體呈下降趨勢,2×MIC石竹烯作用的菌液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度呈下降趨勢,波動小于1×MIC組。由此可知,石竹烯的質(zhì)量濃度越大,越能使胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度穩(wěn)定下降。結(jié)合2.7節(jié)結(jié)果可知,胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度下降可能是因為細胞膜通透性增加,胞內(nèi)蛋白外泄。也可以推測石竹烯能夠引起細菌蛋白合成途徑受阻,破壞蛋白質(zhì)合成,導致代謝功能障礙,甚至細胞死亡。

2.9 石竹烯對B.thermosphacta MDH活力的影響

MDH是生物體進行糖代謝的關鍵酶之一[27]。在線粒體中MDH可調(diào)節(jié)作為生物細胞中重要氧分解代謝途徑的三羧酸循環(huán)的運轉(zhuǎn)速率,作為NADP陽離子自由基的輔酶,在生物合成過程中從代謝產(chǎn)物中接受H+形成NADPH,因此MDH活性能反映細胞代謝是否正常[28]。由圖8可知,空白組和陰性對照組MDH活力在一定時間的波動后極顯著高于1×MIC、2×MIC石竹烯作用的菌液中的MDH活力（P＜0.01）。1×MIC組中MDH活力在12 h前總體呈上升趨勢,12 h后顯著下降,2×MIC組在處理3 h后MDH活力出現(xiàn)顯著下降后在6 h時呈上升趨勢,6 h后MDH活力急速下降并始終低于1×MIC組中MDH活力,這種變化與Hu Yichen等[29]的研究結(jié)果一致。表明石竹烯對MDH活力有一定抑制作用,并且石竹烯的質(zhì)量濃度越大,對MDH活力抑制程度越高,抑制作用也越早顯現(xiàn)出來。MDH活力下降可能是因為石竹烯與MDH相結(jié)合,導致酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,使其活性降低[23]。

圖8 石竹烯對B.thermosphacta細胞中MDH活力的影響Fig.8 Effect of caryophyllene on MDH activity in B.thermosphacta

2.10 石竹烯對B.thermosphacta細胞中PK活力的影響

在糖酵解途徑中,PK是關鍵限速酶之一[30],能促進糖酵解產(chǎn)生丙酮酸,對能量代謝有一定促進作用。丙酮酸在細胞代謝過程中,聯(lián)系著糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)[31]。

圖9 石竹烯對B.thermosphacta細胞中PK活力的影響Fig.9 Effect of caryophyllene on PK activity in B.thermosphacta

由圖9可知,空白組和陰性對照組的PK活力顯著增加（P＜0.05）,隨著時間延長,細菌大量繁殖,糖酵解反應活躍,PK活力增強。經(jīng)1×MIC、2×MIC石竹烯作用的菌液中PK活力雖有輕微波動,但在處理6～24 h內(nèi)PK活力顯著低于空白對照組和陰性對照組（P＜0.05）,表明PK活力受到抑制,則丙酮酸的產(chǎn)生也受到抑制,丙酮酸是生產(chǎn)乙酰輔酶A的原料,乙酰輔酶A是三羧酸循環(huán)中的初始反應物[32],結(jié)合2.9節(jié)結(jié)果,MDH活性也受到了抑制,而MDH是三羧酸循環(huán)中重要的酶,說明三羧酸循環(huán)受到抑制,即影響細胞正常代謝。經(jīng)過石竹烯處理后酶活力的降低可能是由于其與酶側(cè)鏈發(fā)生反應并引起結(jié)構(gòu)變化,進而導致酶構(gòu)象的改變。此外,細菌的呼吸鏈位于細胞膜上,細胞膜參與了細菌各種重要的生命活動,如細胞能量轉(zhuǎn)換、高分子結(jié)構(gòu)的合成和酶分泌等[33]。因此,石竹烯的處理會干擾細菌的呼吸和能量代謝,破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和呼吸鏈上酶系統(tǒng)的功能,從而干擾細菌的正常生命活動。

2.11 石竹烯對細菌基因組DNA的影響

DNA的破壞會阻礙基因的表達,從而阻礙正常酶和受體的合成,甚至導致細菌死亡[34]。因此,采用DNA研究中最敏感的技術(shù)之一——熒光光譜技術(shù)研究石竹烯與DNA的相互作用[35]。

圖10 B.thermosphacta基因組DNA在不同質(zhì)量濃度石竹烯作用下的熒光光譜Fig.10 Fluorescence spectra of genomic DNA of B.thermosphacta in the presence of different concentrations of caryophyllene

如圖10所示,將不同質(zhì)量濃度的石竹烯加入到含有DNA的溶液中后,熒光強度顯著增強且隨著石竹烯質(zhì)量濃度增加而增加。這可能是由于相鄰堿基對之間的平面石竹烯堆疊引起的DNA分子平面性的增加,碰撞頻率溶劑分子以及DNA的減少[36]。結(jié)果表明,石竹烯可能插入DNA螺旋中的堿基對或位于DNA的疏水環(huán)境中,通過與DNA堿基的堆積相互作用可以穩(wěn)定復合物,從而增加DNA的熒光強度。

3 結(jié) 論

石竹烯存在于許多具有抗炎、抑菌、抑制哮喘功能的植物提取物中。較多學者對石竹烯研究局限于含有石竹烯的精油對微生物的抑制作用,但陳奕鵬等[37]簡要說明石竹烯對尖孢鐮刀菌、膠胞炭疽菌和多主棒孢菌具良好的抑制作用,即說明石竹烯具有一定的抑菌作用。本實驗從細胞水平揭示究石竹烯對B.thermosphacta的抑菌機理。結(jié)果表明：石竹烯能夠抑制B.thermosphacta的生長,使其細胞壁和細胞膜的完整性受到破壞,通透性增加,細胞內(nèi)容物如蛋白質(zhì)、鉀離子外滲,MDH、PK活力降低,影響細胞正常生長代謝。而且石竹烯可以與基因組DNA結(jié)合,破壞其結(jié)構(gòu)與構(gòu)象,抑制細菌生長。

綠色、健康、無化學防腐劑添加的天然食品越來越受人喜愛。本實驗探索石竹烯對于在真空包裝和冷藏條件下能生長繁殖的B.thermosphacta的抑菌機理,表明石竹烯在食品中的應用具有良好的潛力。為更有針對性的利用石竹烯作為天然防腐劑抑制食品腐敗菌,將繼續(xù)這一研究方向并探究石竹烯對不同菌種的抑菌機理。