魏育坤，魏好程，伍菱，2，3，楊燊，4，邱緒建，4，黃志勇，倪輝，2，3，*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建廈門361021；3.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361021；4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建廈門361021）

大黃魚（Larimichthyscrocea），鱸形目（Perciformes），石首魚科（Sciaeni-dae），黃魚屬，別名黃魚、大黃花魚、黃瓜魚等，是傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”之一，我國近海主要經(jīng)濟(jì)魚類[1]。大黃魚是我國養(yǎng)殖規(guī)模最大的海水魚，養(yǎng)殖主要集中在福建寧德，2018年大黃魚產(chǎn)量高達(dá)14萬噸，占全國總產(chǎn)量的70%，總產(chǎn)值超百億元。大黃魚肉嫩味美、富含蛋白質(zhì)、微量元素和維生素，對(duì)體質(zhì)虛弱的人具有很好的食療效果，由于具有令人愉快的風(fēng)味，深受消費(fèi)者的喜愛[2]。除食用新鮮的大黃魚外，大黃魚已被加工成黃魚鲞、酒糟黃魚等加工產(chǎn)品。相關(guān)研究表明，魚肉中的揮發(fā)性化合物復(fù)雜，種類繁多，不僅對(duì)魚肉風(fēng)味起著重要的影響[3]，而且是反映魚新鮮程度[4]及進(jìn)行品質(zhì)溯源的重要指標(biāo)[5]；因此，對(duì)大黃魚的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)、監(jiān)控具有重要的意義。

目前，萃取魚類揮發(fā)性物質(zhì)的手段主要包括：同時(shí)蒸餾萃?。╯imultaneous distillation-extraction，SDE）[6]、固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）[6]、超臨界流體萃取 （supercritical fluid extraction，SFE）[7]和溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)萃取（solvent assisted flavour evaporation，SAFE）[8]等。其中，SPME技術(shù)是具有無溶劑性、操作簡(jiǎn)便、高效和靈敏度高等特點(diǎn)[9]，是目前最常用手段之一；但是SPME技術(shù)偏向于提取低沸點(diǎn)的揮發(fā)性化合物，對(duì)高沸點(diǎn)物質(zhì)的提取效率低。SDE技術(shù)融合了水蒸氣蒸餾和有機(jī)溶劑萃取兩種技術(shù)，提取的物質(zhì)側(cè)重于對(duì)中、高沸點(diǎn)的化合物[10]，這一優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)SPME技術(shù)上的缺點(diǎn)。因此，國內(nèi)外學(xué)者常采用SPME和SDE相結(jié)合的方法提取樣品中的揮發(fā)性化合物。Chang等[6]利用SDE和SPME兩種方法提取鱈魚中揮發(fā)性化合物，發(fā)現(xiàn)SDE提取得到24種揮發(fā)性成分，SPME提取得到69種揮發(fā)性成分，其中SDE和SPME提取成分中有10種相同成分。徐永霞等[11]采用SPME結(jié)合SDE法從豬肉湯中提取出77種揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中SPME檢測(cè)出醛類物質(zhì)較多，SDE檢測(cè)到醇類和酯類較多。上述研究表明，SPME法和SDE法對(duì)不同種類化合物的萃取能力存在差異，兩種方法結(jié)合分析同一樣品揮發(fā)性化合物，可以更加全面的反映樣品的風(fēng)味成分。研究學(xué)者通常采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜/嗅聞[12]（gas chromatography-mass spectrometry/olfactometry，GC-MS/O）、氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)器[13]（gas chromatography-flame ionization detector，GCFID）、飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用[14]（time-of-flight mass spectrometry，TOF-MS）等技術(shù)分析食品中揮發(fā)性化合物。其中，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)操作簡(jiǎn)單且分離效果好，被廣泛的用于檢測(cè)食品中復(fù)雜揮發(fā)性化合物。

近幾年，已有研究學(xué)者研究大黃魚的揮發(fā)性化合物。楊茗媛等[15]利用電子鼻和SPME-GC-MS對(duì)大黃魚的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，表明新鮮大黃魚的腥味物質(zhì)主要是己醛、庚醛和辛醛，并且伴隨著對(duì)大黃魚加熱溫度的升高，腥味物質(zhì)呈現(xiàn)減少趨勢(shì)。徐軍方等[16]利用電子鼻和SPME-GC-MS對(duì)比不同冷藏條件下大黃魚風(fēng)味的變化，發(fā)現(xiàn)低溫凍藏可以有效保留大黃魚的風(fēng)味。Mu等[17]利用SPME-GC-MS分析野生大黃魚與養(yǎng)殖大黃魚揮發(fā)性化合物的差異，研究發(fā)現(xiàn)與野生大黃魚相比，養(yǎng)殖大黃魚醛類和烴類物質(zhì)的含量高，酯類物質(zhì)含量較低；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，區(qū)別野生大黃魚與浙江寧波養(yǎng)殖大黃魚的主要成分是辛醛和1-辛烯-3-醇，但大黃魚的揮發(fā)性成分尚未得到充分鑒定。

本研究以我國大黃魚主產(chǎn)區(qū)--福建寧德市養(yǎng)殖的凍鮮大黃魚為研究對(duì)象，采用的SPME和SDE兩種方法對(duì)大黃魚中揮發(fā)性化合物萃取，并結(jié)合GC-MS和相對(duì)氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）進(jìn)行分析研究，鑒定大黃魚的主要揮發(fā)性成分，尤其是香氣貢獻(xiàn)成分，為全面了解大黃魚風(fēng)味品質(zhì)及建立溯源技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍鮮大黃魚：寧德市橫嶼島水產(chǎn)有限公司，經(jīng)宰殺、去內(nèi)臟，其個(gè)體長(zhǎng)約30 cm、重500 g左右。

環(huán)己酮、正構(gòu)烷烴（C8-C40）、乙醇、正己烷（色譜級(jí)）：Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QP-2010 Plus氣相色譜質(zhì)譜串聯(lián)儀、Rtx-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 色譜柱、65 μm CAR/PDMS萃取頭：日本島津公司；57330-U手動(dòng)SPME進(jìn)樣器：美國Supelco公司；Likens-Nickerson同時(shí)蒸餾萃取裝置：鄭州鑫瑞化驗(yàn)廠；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；XB-CPJ高速多功能粉碎機(jī)：永康市久品工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大黃魚樣品前處理

凍鮮大黃魚在流水的條件下解凍約2 h，去掉魚頭、魚鰭、魚鱗、黑皮和主骨，用絞肉機(jī)搗碎魚肉，并分裝，置于-18℃的環(huán)境下保藏，備用。

1.3.2 SPME提取大黃魚揮發(fā)性化合物方法

SPME法提取揮發(fā)性化合物方法參照相關(guān)的文獻(xiàn)[18]，準(zhǔn)確稱取10 g凍鮮大黃魚置于50 mL的頂空瓶，加入10 mL的蒸餾水和10 μL濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮，密封頂空瓶，置于70℃的水浴鍋中平衡30 min。將經(jīng)250℃老化后的萃取頭通過瓶蓋插入頂空瓶中，萃取頭暴露在頂空瓶的頂空位置，吸附30 min。吸附結(jié)束后，迅速將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，解吸3 min，由GC-MS進(jìn)行后續(xù)的分析鑒定。

1.3.3 SDE提取大黃魚揮發(fā)性化合物方法

SDE法提取揮發(fā)性化合物方法參考文獻(xiàn)[19]，準(zhǔn)確稱取50 g經(jīng)攪碎的凍鮮大黃魚肉樣和200 mL的蒸餾水于1 000 mL的圓底燒瓶，量取100 mL正己烷于500 mL的平底燒瓶，將兩個(gè)燒瓶分別連接在同時(shí)蒸餾萃取裝置的兩端，并采用電熱套進(jìn)行加熱。通過控制兩邊電壓，達(dá)到同時(shí)沸騰的狀態(tài)，整個(gè)萃取的過程時(shí)長(zhǎng)80 min。收集萃取液，添加過量的無水硫酸鈉，去除萃取液中多余的水分，靜置過夜，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 mL，密封，置于-18℃的環(huán)境下保存。GC-MS分析前，取100 μL樣品，用正己烷稀釋4倍，加入1 μL濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮，進(jìn)樣量1 μL進(jìn)行GCMS分析。

進(jìn)行數(shù)字線劃圖工作的開展時(shí)，一般采用全數(shù)字?jǐn)z影測(cè)量工作站的方式完成測(cè)量任務(wù)，同時(shí)運(yùn)用有關(guān)圖像編輯軟件予以編輯處理，確保具體的格式為DWG。此過程中應(yīng)做到下述幾點(diǎn)：其一，開展地形圖測(cè)繪時(shí)，應(yīng)建立與數(shù)字匹配的地面模型，并明確具體方向。而此環(huán)節(jié)中出的差異，由于運(yùn)用了自動(dòng)交互操控的方式，因此需以具體操控步驟予以科學(xué)安排測(cè)量工作內(nèi)容，讓誤差處于可控狀態(tài)下；第二，測(cè)繪地形圖以前，應(yīng)保證定位的科學(xué)性，讓各個(gè)因素均存在相應(yīng)準(zhǔn)確的線型、顏色和標(biāo)準(zhǔn)的代碼；第三，采用加大地形圖測(cè)繪人員培訓(xùn)力度的方式，提升其專業(yè)能力，讓所采集的地物和地貌信息誤差率得以下降，達(dá)到最小的目的。

1.3.4 GC-MS分析大黃魚揮發(fā)性化合物條件

色譜條件：氣相色譜柱為Rtx-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。載氣為高純氦氣（純度99.999%），柱流量3 mL/min，不分流進(jìn)樣。

升溫程序：進(jìn)樣口溫度為220℃，初始溫度50℃保持5 min，以6℃/min的速度升溫至250℃保持5 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，電離方式EI，電離能量70 eV，接口溫度250℃，掃描方式設(shè)為SCAN模式進(jìn)行定性分析，離子碎片的掃描范圍m/z 35～450。溶劑延遲時(shí)間2.5 min。定量分析時(shí)質(zhì)譜掃描方式設(shè)為SIM模式。

1.4 揮發(fā)性化合物的定性分析

對(duì)比質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST08、NIST08s、FFNSC1.3）進(jìn)行相似度檢索，根據(jù)不同化合物的基峰、質(zhì)荷比進(jìn)行串聯(lián)檢索與人工解析，化合物鑒定標(biāo)準(zhǔn)為其質(zhì)譜匹配度大于80%。計(jì)算待測(cè)化合物的保留指數(shù)并與文獻(xiàn)中報(bào)道的保留指數(shù)對(duì)比定性。保留指數(shù)的計(jì)算參照Kratz和Vandendool[20]的方法：

式中：RIX為目標(biāo)化合物的保留指數(shù)；RTx為目標(biāo)化合物的保留時(shí)間，min；RTn+1、RTn為目標(biāo)化合物出峰前后相鄰兩個(gè)正構(gòu)烷烴的出峰時(shí)間，min。

1.5 揮發(fā)性化合物的定量分析

定量分析采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，根據(jù)環(huán)己酮的濃度估算待測(cè)物的含量，計(jì)算公式為：

1.6 相對(duì)氣味活度值法（ROAV）確定大黃魚關(guān)鍵香氣成分

參照劉登勇等[21]的方法，大黃魚關(guān)鍵香氣成分采用ROAV值進(jìn)行評(píng)價(jià)，定義對(duì)香氣貢獻(xiàn)最大的組分為ROAVs=100，其他揮發(fā)性化合物的ROAV值計(jì)算公式如下：

各揮發(fā)性化合物的ROAV≤100，本研究認(rèn)為ROAV≥1的揮發(fā)性化合物是大黃魚的關(guān)鍵香氣成分，0.1≤ROAV＜1的揮發(fā)性化合物對(duì)大黃魚整體的風(fēng)味有修飾作用[22]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

通過Microsoft Office Excel 2010軟件計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME和SDE提取大黃魚中揮發(fā)性化合物定性分析

采用SPME和SDE兩種方法提取大黃魚中的揮發(fā)性化合物，結(jié)合GC-MS分析，得到的總離子流圖如圖1所示。

圖1 大黃魚SPME和SDE提取物中揮發(fā)性化合物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile compounds of SPME and SDE extracts from large yellow croaker

從圖1發(fā)現(xiàn)，SPME出峰靠前且較集中，而SDE出峰分布廣泛且后期出峰多，說明SPME法適用于提取低沸點(diǎn)的揮發(fā)性化合物，SDE法適合提取中、高沸點(diǎn)的揮發(fā)性化合物。這個(gè)現(xiàn)象與Li等[23]采用SPME和SDE對(duì)草魚湯揮發(fā)性化合物的出峰情況相似。

根據(jù)相似度檢索、特征離子碎片分析以及參照相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定結(jié)果如表1所示。

由表1可知，SPME提取到29種揮發(fā)性化合物，包括醛類12種、醇類3種、酮類3種、芳香烴化合物4種、烴類5種和酯類2種；SDE提取到26種揮發(fā)性化合物，包括醛類6種、醇類2種、酮類5種、烴類2種、酯類4種和其他類7種；兩種方法共同提取到6種揮發(fā)性化合物，分別為壬醛、癸醛、反，反-2，4-癸二烯醛、2-十一碳烯醛、2，6，10，14-四甲基-十五烷、十六烷酸乙基酯。SPME-GC-MS前期檢測(cè)到己醛、反，反-2，4-庚二烯醛、辛醛和反-2-辛烯醛沸點(diǎn)很低，但是SDE-GC-MS中未檢測(cè)到；SDE-GC-MS后期檢測(cè)到2，4-二-叔丁基苯酚、棕櫚酸、十六碳酰胺、油酸酰胺、硬脂酸酰胺和芥酸酰胺，其沸點(diǎn)普遍很高，在SPMEGC-MS中未檢測(cè)到，這可能是SDE萃取是在高溫下反復(fù)蒸煮進(jìn)行的，對(duì)低沸點(diǎn)化合物萃取能力弱[24]。SPME和SDE兩種方法提取大黃魚揮發(fā)性化合物經(jīng)GC-MS檢測(cè)，共鑒定出7大類49種揮發(fā)性化合物，相關(guān)學(xué)者[2]采用SPME提取養(yǎng)殖大黃魚揮發(fā)性化合物，檢測(cè)出39種揮發(fā)性化合物，說明兩種方法提取大黃魚揮發(fā)性化合物更全面。

表1 大黃魚SPME和SDE提取物中揮發(fā)性化合物鑒定結(jié)果Table 1 Identification of volatile compounds of SPME and SDE extracts from large yellow croaker

續(xù)表1 大黃魚SPME和SDE提取物中揮發(fā)性化合物鑒定結(jié)果Continue table 1 Identification of volatile compounds of SPME and SDE extracts from large yellow croaker

2.2 SPME和SDE提取大黃魚中揮發(fā)性化合物定量分析

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各揮發(fā)性化合物的濃度和相對(duì)含量，結(jié)果如表1所示，各類化合物的相對(duì)含量如圖2所示。

圖2 SPME和SDE提取大黃魚揮發(fā)性化合物的類別含量圖Fig.2 Classification of volatile compounds of SPME and SDE extractions from large yellow croaker

從圖2中發(fā)現(xiàn)，SPME和SDE兩種方法結(jié)合GC-MS檢測(cè)到同類揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量具有明顯的差異，SPME-GC-MS檢測(cè)到相對(duì)含量最多的化合物是醛類（59.27%），其次是烴類（16.62%）、醇類（10.64%）、酮類（8.62%）、芳香烴（4.34%）和酯類（0.52%），SDE-GC-MS檢測(cè)到相對(duì)含量最多的化合物是酮類（33.55%），其次是醛類（26.38%）、烴類（9.14%）、酯類（5.64%）、醇類（5.47%）和其他類（19.81%）。此現(xiàn)象表明SPME對(duì)醛類、醇類、烴類和芳香烴化合物提取效果好，而SDE對(duì)酮類和酯類化合物提取效果好。因此，采用兩種方法結(jié)合分析，避免單一的提取手段對(duì)不同種類揮發(fā)性化合物的選擇性，對(duì)大黃魚中的各類揮發(fā)性化合物定量更充分。

從表1可知，SPME提取大黃魚含量最高的揮發(fā)性化合物是壬醛（1 376.84 ng/g），但經(jīng)SDE提取到壬醛含量較低（89.74 ng/g），楊茗媛等[15]在研究浙江舟山市養(yǎng)殖大黃魚的背部揮發(fā)性化合物發(fā)現(xiàn)，壬醛的含量最高（1 452.10 ng/g），并且隨著溫度的升高，含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。SDE提取到含量最高的揮發(fā)性化合物是2-辛酮（583.16 ng/g），該物質(zhì)在相關(guān)學(xué)者[18]采用 SPME提取大黃魚風(fēng)味的研究中未被發(fā)現(xiàn)。SPME提取癸醛、反，反-2，4-癸二烯醛和十六烷酸乙基酯的濃度比SDE提取的濃度低，可能是萃取頭吸附面積有限引起的[25]。SPME提取2-十一碳烯醛的含量比SDE提取的含量高，從7.23 ng/g降至13.47 ng/g，在相關(guān)學(xué)者[16]對(duì)大黃魚的揮發(fā)性化合物研究中未被報(bào)道。

上述研究表明，SPME和SDE兩種方法對(duì)提取的揮發(fā)性化合物存在一定的選擇性，兩種方法結(jié)合GCMS分析大黃魚的揮發(fā)性化合物，可以更加全面的了解揮發(fā)性成分信息。

2.3 大黃魚的關(guān)鍵香氣成分分析

揮發(fā)性化合物對(duì)大黃魚的貢獻(xiàn)程度取決于它在樣品中的相對(duì)含量和感官閾值。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)已報(bào)道的香味閾值，計(jì)算各揮發(fā)性化合物的ROAV值，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，SPME提取大黃魚的揮發(fā)性化合物，得到9種關(guān)鍵的香氣成分以醛類、醇類和烴類為主，ROAV值由高到低依次為：辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、反，正-2，6-壬二烯醛、反-2-癸烯醛、癸醛和檸檬烯，對(duì)大黃魚風(fēng)味有修飾作用的揮發(fā)性化合物是反-2-壬烯醛、己醛、十二醛和反，反-2，4-庚二烯醛。SDE提取大黃魚的揮發(fā)性化合物，得到3種關(guān)鍵的香氣成分，以醛類為主，分別是反，反-2，4-癸二烯醛、癸醛和壬醛，對(duì)大黃魚風(fēng)味有修飾作用的揮發(fā)性化合物是2-己酮。

表2 SPME和SDE提取大黃魚揮發(fā)性化合物的相對(duì)氣味活度值Table 2 Relative odor activity value（ROAV）of volatile compounds of SPME and SDE extractions from large yellow croaker

醛類物質(zhì)主要來源于脂肪組織發(fā)生氧化反應(yīng)，且該類物質(zhì)的閾值較低[26]，對(duì)魚體的風(fēng)味影響頗大，被認(rèn)為是魚肉的主要風(fēng)味。辛醛[27]、壬醛[27]、反，反-2，4-癸二烯醛[28]是油酸氧化的產(chǎn)物和亞油酸經(jīng)氧化成氫過氧化物裂解的產(chǎn)物，辛醛具有油脂味，壬醛具有油脂味、腥味，反，反-2，4-癸二烯醛具有油脂味；癸醛是氨基酸降解的產(chǎn)物[29]，具有甜香和花香；其它醛類的關(guān)鍵香氣成分是反-2-辛烯醛、反，正-2，6-壬二烯醛和反-2-癸烯醛，主要呈現(xiàn)油脂味和腥味。醇類物質(zhì)是脂質(zhì)氧化、氨基酸代謝的產(chǎn)物[30]，不飽和醇類物質(zhì)閾值較低[31]，對(duì)大黃魚的風(fēng)味有影響。SPME提取的不飽和醛類物質(zhì)1-辛烯-3-醇[32]由亞油酸經(jīng)氧化為氫過氧化物裂解的產(chǎn)物，且具有土腥味和蘑菇味，且該物質(zhì)普遍存在于魚的揮發(fā)性化合物中。烴類物質(zhì)可能是類胡蘿卜素的分解產(chǎn)物[33]，SPME提取的關(guān)鍵香氣成分檸檬烯呈現(xiàn)柑橘味。

3 結(jié)論

本研究采用SPME和SDE結(jié)合GC-MS分析大黃魚揮發(fā)性化合物，共檢測(cè)出49種揮發(fā)性化合物，其中SPME法29種，SDE法26種。兩種方法對(duì)不同種類揮發(fā)性化合物提取能力不同，SPME提取的揮發(fā)性化合物以醛類、醇類、烴類和芳香烴化合物為主，SDE提取的揮發(fā)性化合物以酮類和酯類化合物為主。SDE提取到2-十一碳烯醛和2-辛酮在相關(guān)研究中未被報(bào)道。經(jīng)ROAV分析確定了9種關(guān)鍵香氣成分，對(duì)大黃魚風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)是辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛。通過兩種方法提取大黃魚揮發(fā)性化合物與單一的提取方法對(duì)比得知，兩種方法提取的揮發(fā)性化合物更全面、更準(zhǔn)確，該結(jié)果為全面了解大黃魚風(fēng)味品質(zhì)及建立溯源技術(shù)奠定基礎(chǔ)，之后需要結(jié)合嗅聞技術(shù)及香氣重組進(jìn)一步確定大黃魚的香氣構(gòu)成。