閆曉博，李予煊，陳章風，郝佳夢，郭軍鵬，劉宏巖△

(1. 北京市朝陽區(qū)三間房社區(qū)衛(wèi)生服務中心，北京 100020； 2. 長春中醫(yī)藥大學，長春 130117)

近年來，我國急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)發(fā)病率趨于上升態(tài)勢[1]，因此預防AMI的發(fā)生就成為一個重要的衛(wèi)生健康問題。細胞凋亡是心肌細胞死亡的主要形式之一，若能有效地抑制心肌細胞凋亡，可減少心肌細胞壞死程度[2]，從而降低大面積梗死風險。目前認為B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)在啟動細胞凋亡程序中發(fā)揮著相互制衡的調(diào)控作用。當AMI發(fā)生之后，心肌凋亡蛋白Bcl-2和Bax動態(tài)平衡被打破，隨之可出現(xiàn)心肌細胞凋亡的現(xiàn)象。因此在發(fā)病早期，及時、有效地抗凋亡可降低AMI的致殘率和死亡率。

烏頭赤石脂湯是《金匱要略》中烏頭赤石脂丸的湯劑形式。原文記載胸痹心痛重癥的特點是“心痛徹背，背痛徹心”[3]。依據(jù)原文對發(fā)病癥狀的描述，可將其歸于AMI范疇。臨床相關(guān)研究表明，烏頭赤石脂湯聯(lián)合丹參注射液對AMI具有顯著療效，可縮短肌酸激酶(creatine kinase,CK)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)恢復時間，降低不良反應的發(fā)生[4-5]。藥理實驗已證實，烏頭赤石脂湯對缺血心肌的保護可能與降低血液黏稠度有關(guān)[5]，但對烏頭赤石脂湯干預AMI細胞凋亡的實驗研究鮮有報道。因此，本實驗在不改變藥味組成、量效關(guān)系的基礎上，將烏頭赤石脂丸劑改為湯劑，并探討其對AMI大鼠心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(230±20)g，由長春市易思實驗動物技術(shù)有限責任公司提供(許可證號SCXK(吉)2016-0003)，隨機分為正常組、模型組、尿激酶組和烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組，參考相關(guān)造模文獻[6-7]復制AMI大鼠模型。本實驗已通過長春中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 主要試劑與儀器

CTNT、CK-MK試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)；Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗體、Bax兔抗大鼠多克隆抗體及辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體(Proteintech公司)。病理組織切片機、石蠟包埋機、DMLS2光學顯微鏡(德國LEICA公司)；VDS凝膠成像儀(Phamacia Biotech公司)。

1.3 實驗藥品及給藥方法

注射用尿激酶(批號H10920040)，購自南京南大藥業(yè)有限責任公司；注射用青霉素鈉(批號H13020657)，購自華北制藥股份有限公司；烏頭赤石脂湯所含的制川烏頭、炮附子、干姜、蜀椒和赤石脂，購自吉林省同仁大藥房。

給藥方法：每日各組大鼠治療1次，共持續(xù)1周。正常組、模型組給予等量生理鹽水；烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組分別按1.12 g/只、3.36 g/只、10.08 g/只的生藥量給予湯劑治療，尿激酶組按5萬U/ml·只給予腹腔注射治療。術(shù)前3 d和術(shù)后1 d，青霉素給予皮下注射預防感染。

1.4 主要指標及方法

1.4.1 測定CTNT、CK-MB含量 腹主動脈采集約5 ml全血，3000rpm離心15 min，取約1 ml上清液。運用比色法，按照試劑盒說明書的操作步驟，測定各組大鼠血清中肌鈣蛋白T(troponin T,CTNT)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes,CK-MB)含量。

1.4.2 觀察心肌病理學變化 用生理鹽水洗凈心臟后固定、脫水、包埋，切片機切約5um厚度的心肌標本，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片，鏡下觀察各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)的細胞形態(tài)學變化。

1.4.3 檢測心肌Bcl-2、Bax表達 在左心室梗死邊緣區(qū)取約50 mg心肌組織，添加1 ml裂解液混合物，冰上持續(xù)裂解30 min,提取心肌組織蛋白，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參蛋白，使用超敏ECL化學發(fā)光檢測靶蛋白Bcl-2和Bax的含量，使用VDS凝膠成像儀拍照。將GAPDH條帶灰度值計為1，計算出各組的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清CTNT、CK-MK含量變化

表1示，經(jīng)治療1周后，模型組明顯高于正常組血清CTNT及CK-MK含量(P<0.01)；烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組和尿激酶組均明顯低于心梗模型組血清CTNT及CK-MK水平(P<0.05,P<0.01)。

表1 各組大鼠CTNT、CK-MK、Bcl-2、Bax含量比較

2.2 各組大鼠心肌細胞病理形態(tài)變化

圖1示，正常組心肌細胞核完整，心肌纖維排列有序。模型組心肌細胞核基本消失，心肌纖維無序紊亂且有大量炎癥細胞浸潤。烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組和尿激酶組心肌細胞病理形態(tài)皆有明顯好轉(zhuǎn)。其中，烏頭赤石脂湯低劑量組心肌仍有少量炎性細胞散在分布和紅細胞片狀聚集；烏頭赤石脂湯中、高劑量組和尿激酶組紅細胞堆積現(xiàn)象明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少，心肌纖維排列較為有序。

圖1 各組大鼠心肌細胞病理形態(tài)變化(高倍鏡×400)

2.3 各組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax表達變化

圖2表1示，模型組Bcl-2表達顯著低于正常組(P<0.01)，而Bax表達顯著高于正常組(P<0.01)。烏頭赤石脂湯低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義；烏頭赤石脂湯中、高劑量組和尿激酶組較模型組Bcl-2表達顯著升高及Bax表達顯著降低(P<0.05；P<0.01)。烏頭赤石脂湯低、中劑量組不如尿激酶組Bcl-2表達明顯下降(P<0.01)，但高劑量組與尿激酶組無明顯差異；烏頭赤石脂湯低劑量組Bax表達明顯高于尿激酶組(P<0.01)，中、高劑量組與尿激酶組比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 烏頭赤石脂湯對心梗大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

3 討論

目前，AMI的主要治療方法是藥物溶栓和介入手術(shù)，其中藥物溶栓在臨床實踐中占據(jù)重要地位。研究提示，AMI發(fā)病時溶栓越早冠脈再通率則越高[8]，但溶栓也有一定時效性。尿激酶作為第一代溶栓劑，具有較強的溶栓能力，但對纖維蛋白缺乏特異性，可增加全身出血、惡性心律失常等風險。本實驗研究結(jié)果表明，烏頭赤石脂湯高劑量在降低心肌酶釋放、改善心肌病理形態(tài)以及減少細胞凋亡程度方面與尿激酶相近，說明烏頭赤石脂湯高劑量與尿激酶在保護受損心肌、改善心肌功能及干預細胞凋亡方面的功效相當。但就并發(fā)癥而言，烏頭赤石脂湯低、中、高劑量組在實驗治療周期內(nèi)均未出血，而尿激酶組在治療后第1～2天里有少量血液滲出，說明烏頭赤石脂湯的出血幾率較小。

烏頭赤石脂湯由制川烏頭、炮附子、干姜、蜀椒和赤石脂組成。制烏頭和炮附子在AMI發(fā)作時，可發(fā)揮強心、鎮(zhèn)痛、抗缺血等作用，干姜可改善冠脈收縮和舒張功能，及時緩解急性心肌缺血缺氧的狀態(tài)[9-10]。蜀椒色赤入血歸于心，可引方中諸藥直達病所[11]，且有一定抗血栓作用。4藥相合可加速恢復受損心肌的生理功能，緩解急性發(fā)作時的劇痛程度以及改善梗死相關(guān)冠脈的血液供應。赤石脂味酸澀、性甘溫，不僅能補心養(yǎng)血、固澀虛陽，還能斂辛散之性、抑毒性吸收[12-13]?，F(xiàn)代藥理證實，赤石脂具有止血和抗血栓的作用[14]，提示赤石脂不僅能確保余藥溫通心脈，還可防離經(jīng)之血產(chǎn)生，全方對AMI起干預作用的關(guān)鍵在于通心脈、防瘀阻，以降低梗死風險度。

總之，本實驗研究的初步結(jié)論是在療效相近的前提下，烏頭赤石脂湯高劑量組的出血風險更小，使用安全性更高。因此，若將烏頭赤石脂湯高劑量制備成舌下含服或靜脈滴注等劑型，進一步提高生物利用度，以保證快速吸收入血，可縮短心肌總?cè)毖獣r間，降低心肌梗死的程度。其內(nèi)在機理可能與上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax有關(guān)，但最終是依賴激活caspase通路還是非caspase通路尚需進一步的深入研究。