張世霞，李聚林，馮五金

(1. 山西中醫(yī)藥大學(xué),山西 晉中 030619； 2. 山西省中醫(yī)院,太原 030012)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。目前，放療、化療等治療方式在一定程度上提高了胃癌患者的生存率，但常規(guī)的化療藥物存在易復(fù)發(fā)、毒副作用大等缺點(diǎn)[1]。中國傳統(tǒng)的中草藥具有廣泛的藥用價(jià)值，且具有安全、高效、副作用低等優(yōu)點(diǎn)，是抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)之一[2]。小檗堿是中藥黃柏、黃連的主要成分，又名黃連素，具有消炎、降血脂、抗氧化等作用[3]。研究顯示，小檗堿可通過抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，在機(jī)體正常生理功能維持和疾病發(fā)生中均有調(diào)控功能[6]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤中異常激活，其關(guān)鍵蛋白β-catenin和下游靶基因c-myc過度表達(dá)，抑制其激活后可通過影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。研究報(bào)道稱，小檗堿可抑制結(jié)腸癌等癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活，二者之間可能存在一定聯(lián)系[9]。本研究旨在明確小檗堿和Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞MKN45增殖、凋亡及糖代謝的影響，為小檗堿和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑治療胃癌提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)試劑

胃癌細(xì)胞(MKN45，美國ATCC)；胎牛血清(杭州四季青)；青霉素、RPMI1640培養(yǎng)基、鏈霉素、噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT，美國Sigma)；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Cleaved Caspase-3)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、單克隆抗體、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)抗體、c-myc抗體(美國Abcam)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)，蛋白定量試劑盒 (PA115，北京TIANGEN)；細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒(P1250，北京普利萊)；乳酸含量檢測(cè)試劑盒(南京森貝伽)；丙酮酸激酶活性檢測(cè)試劑盒(武漢艾美捷)；己糖激酶活性檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶)；膜聯(lián)蛋白 V-FITC(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium Iodide,PI)凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MKN45細(xì)胞從液氮中取出后37 ℃快速溶解，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，于飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過80%以后吸棄上清液，0.25%胰蛋白酶消化后以1∶2的比例進(jìn)行傳代，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 小檗堿對(duì)MKN45細(xì)胞增殖影響

MKN45細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)過夜后棄培養(yǎng)液，分別加入含小檗堿終濃度0、6、12、24、48和96 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。棄上清液每孔加入150 μL二甲基亞砜，充分溶解結(jié)晶物后混合均勻，于酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(absorbance,A值)，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concertration,IC50)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.4 細(xì)胞分組

MKN45細(xì)胞分為對(duì)照組、小檗堿組、FH535組和聯(lián)合組。小檗堿組終濃度24 μmol/L小檗堿作用于MKN45細(xì)胞48 h；FH535組20 μmol/L Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑FH535作用于MKN45細(xì)胞48 h；聯(lián)合組24 μmol/L小檗堿與20 μmol/L FH535共同作用于MKN45細(xì)胞48 h，對(duì)照組中不加任何藥物。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞分組培養(yǎng)后，胰蛋白酶消化，PBS清洗細(xì)胞并調(diào)整濃度為6×105個(gè)/mL。吸取1 mL細(xì)胞懸浮液，1000rpm離心10 min。棄上清液，加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。再依次加各5 μL的碘化丙啶(propidium Iodide,PI)和膜聯(lián)蛋白 V-FITC(annexin V-FITC)，室溫避光孵育15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.6 糖酵解水平檢測(cè)

細(xì)胞分組培養(yǎng)后收集細(xì)胞及培養(yǎng)液上清，用乳酸含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清中的乳酸水平，用丙酮酸激酶活性檢測(cè)試劑盒和己糖激酶活性檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞中的丙酮酸激酶和己糖激酶活性。用實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比值作為乳酸相對(duì)含量、丙酮酸激酶相對(duì)活性和己糖激酶相對(duì)活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.7 β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平檢測(cè)

細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取適量蛋白樣品加入等體積的上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。5%濃縮膠和12%分離膠進(jìn)行蛋白電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜，37 ℃、5%脫脂奶粉孵育1 h。然后分別加入β-catenin(稀釋度1∶500)、c-myc(稀釋度1∶800)、Cleaved Caspase-3(稀釋度1∶600)抗體，4 ℃孵育過夜。次日加入二抗(稀釋度1∶2000)，37 ℃孵育反應(yīng)1 h。加入ECL顯影，采用Bio-Rad采集圖像。以GAPDH為參照，Quantity One軟件分析蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)MKN45細(xì)胞增殖的影響

表1示，與未使用小檗堿作用的MKN45細(xì)胞比，小檗堿作用MKN45細(xì)胞后吸光度值明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，表明小檗堿可劑量依賴性地抑制MKN45細(xì)胞增殖。經(jīng)計(jì)算小檗堿作用MKN45細(xì)胞的IC50值為(24.38±2.81)μmol/L，因此選用24 μmol/L的小檗堿用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 小檗堿作用后MKN45細(xì)胞A值變化比較

2.2 小檗堿和Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)MKN45細(xì)胞增殖的影響

表2示，與對(duì)照組比較，小檗堿組、FH535組、聯(lián)合組細(xì)胞A值均顯著降低(P<0.05)。與小檗堿組或FH535組比較，聯(lián)合組細(xì)胞A值顯著降低(P<0.05)，表明小檗堿和抑制Wnt信號(hào)通路均能夠抑制MKN45細(xì)胞增殖，且二者具有協(xié)同作用。

表2 小檗堿和Wnt信號(hào)通路抑制劑作用后MKN45細(xì)胞A值變化

2.3 小檗堿和Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)MKN45細(xì)胞凋亡的影響

圖1表3示，與對(duì)照組比較，小檗堿組、FH535組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。與小檗堿組或FH535組比較，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，表明小檗堿和抑制Wnt信號(hào)通路均能促進(jìn)MKN45細(xì)胞凋亡，且二者具有協(xié)同作用。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MKN45細(xì)胞凋亡

表3 小檗堿和Wnt信號(hào)通路抑制劑作用后MKN45細(xì)胞凋亡率變化比較

2.4 小檗堿和Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)MKN45細(xì)胞糖酵解的影響

表4示，與對(duì)照組比較，小檗堿組、FH535組、聯(lián)合組細(xì)胞丙酮酸激酶、己糖激酶及乳酸相對(duì)含量均顯著降低(P<0.05)。與小檗堿組或FH535組比較，聯(lián)合組細(xì)胞丙酮酸激酶、己糖激酶及乳酸相對(duì)含量均顯著降低(P<0.05)，表明小檗堿和抑制Wnt信號(hào)通路均能抑制MKN45細(xì)胞糖酵解，且二者具有協(xié)同作用。

2.5 小檗堿和Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)胃MKN45細(xì)胞β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平的影響

表4 小檗堿和Wnt信號(hào)通路抑制劑作用后MKN45細(xì)胞糖酵解相關(guān)指標(biāo)變化比較

圖2表5示，與對(duì)照組比較，小檗堿組、FH535組、聯(lián)合組MKN45細(xì)胞β-catenin和c-myc蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與小檗堿組或FH535組比較，聯(lián)合組MKN45細(xì)胞β-catenin和c-myc蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，表明小檗堿能夠抑制MKN45細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的激活，促進(jìn)Caspase-3活化。

圖2 Western blot檢測(cè)β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平

表5 小檗堿和Wnt信號(hào)通路抑制劑作用后MKN45細(xì)胞β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3水平變化比較

3 討論

小檗堿常用來治療胃腸道疾病，具有較長(zhǎng)的用藥歷史。隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，小檗堿可通過抑制細(xì)胞增殖、干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移等發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。研究顯示，不同濃度的小檗堿作用胃癌細(xì)胞后可抑制胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[11-12]。本研究結(jié)果顯示，小檗堿作用后，胃癌細(xì)胞增殖活性下降，凋亡率升高。這與之前的研究報(bào)道結(jié)果一致。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤發(fā)展有關(guān)，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等過程中具有重要作用。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在腫瘤中表達(dá)下調(diào)[13]。Wnt的配體、卷曲蛋白、低脂密度蛋白相關(guān)受體可以特異性地結(jié)合形成復(fù)合物，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促使散亂蛋白磷酸化，抑制β-catenin磷酸化，而未被磷酸化的β-catenin不能與蛋白復(fù)合物特異性識(shí)別，從而導(dǎo)致β-catenin進(jìn)入到細(xì)胞核，促進(jìn)下游靶基因c-myc的表達(dá)[14-16]。何百成等[17]通過運(yùn)用嵌合體報(bào)告質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以抑制細(xì)胞中β-catenin的激活。本研究結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑可抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。小檗堿或Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑均可降低胃癌細(xì)胞中β-catenin和c-myc表達(dá)，且兩者聯(lián)合作用效果更明顯，提示小檗堿通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

癌細(xì)胞具有與正常細(xì)胞不同的能量代謝途徑，正常細(xì)胞只有在缺氧條件下通過糖酵解途徑供能，而腫瘤細(xì)胞無論是在氧氣充足還是氧氣不足的條件下都優(yōu)先以糖酵解方式進(jìn)行能量代謝，這被稱之為“有氧糖酵解”[18-20]。己糖激酶、丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的關(guān)鍵限速酶，其活性越高糖酵解速度越快[21]。乳酸是糖酵解的產(chǎn)物之一，檢測(cè)其含量的高低可以間接反映細(xì)胞內(nèi)糖酵解水平[22]。研究顯示，小檗堿可以抑制乳腺癌細(xì)胞能量代謝水平，Wnt/β-catenin影響胰腺癌細(xì)胞糖酵解水平[23-24]。本研究表明，小檗堿或Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑作用后胃癌細(xì)胞中己糖激酶、丙酮酸激酶活性均降低，培養(yǎng)液上清中乳酸含量也降低，表明小檗堿或Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑可降低胃癌細(xì)胞糖酵解水平，且二者聯(lián)合作用效果更好，提示小檗堿通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路干擾胃癌細(xì)胞糖酵解。

總之，小檗堿和Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑均能抑制胃癌細(xì)胞增殖和糖酵解，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，二者聯(lián)合后抗腫瘤作用更為明顯。此外，小檗堿可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活發(fā)揮作用，為其用于胃癌的治療提供理論依據(jù)。