駱小娟，張照慶，尹 晶，徐 蕓，段軼軒，夏 楊，居詩如

(武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)康復(fù)科，武漢 430061)

第三腰椎橫突綜合征是由于急性損傷或慢性勞損，使局部發(fā)生炎性腫脹、充血滲出等病理變化的疾病，臨床多采用保守治療。內(nèi)熱針是一種新型的針刺療法，結(jié)合現(xiàn)代電子技術(shù)和工藝材料技術(shù)的改造，可通過內(nèi)部加熱傳導(dǎo)熱能，并具有溫度可控、熱能集中的特點，在治療軟組織損傷疾病中療效顯著[1-2]。急性損傷和慢性勞傷所致的第三腰椎橫突綜合征，會使損傷局部發(fā)生炎性腫脹，產(chǎn)生無菌炎癥反應(yīng)[3]。有研究表明，內(nèi)熱針能夠減輕損傷組織的無菌性炎癥[4]。因此，本研究擬通過構(gòu)建第三腰椎橫突綜合征模型大鼠，探討內(nèi)熱針治療對第三腰椎橫突綜合征大鼠損傷組織炎癥反應(yīng)的影響及可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

明膠海綿(0.5 cm×0.5 cm)，由南京金陵藥業(yè)公司生產(chǎn)；羅哌卡因(批準(zhǔn)文號H20020248)，由AstraZeneca AB公司生產(chǎn)；得寶松(批準(zhǔn)文號H20130187)，由Schering-Plough Labo N.V.公司生產(chǎn)；甲鈷胺(批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字H20030812)，由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；兔抗人NF-κB p65單克隆抗體(貨號#8242)、兔抗人Phospho-Akt (Ser473)、單克隆抗體(貨號# 4060S)、兔抗人GAPDH單克隆抗體(貨號#5174)均購自美國Cell Signaling Technology公司；大鼠白介素6(IL-6)ELISA試劑盒(貨號RA20607)、大鼠白介素8(IL-8)ELISA試劑盒(貨號RA20553)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(貨號RA20035)、大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(貨號RA20020)均由Bio-swamp公司提供；內(nèi)熱針治療儀(型號K，內(nèi)熱針總長10 cm，針柄長4 cm，針體長6 cm，針體產(chǎn)熱長度6 cm)由濟南佳科醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)；低溫高速離心機(型號K3，美國Thermo公司生產(chǎn))；全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀由上海天能科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 動物及分組

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量300～350 g，鼠齡3個月左右，購買于湖北省動物實驗中心(動物合格證編號SCXK(鄂)2015-0018)。同一條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、藥物組、內(nèi)熱針組、普通針刺組和溫針灸組6組各15只。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學(xué)要求。

1.3 第三腰椎橫突綜合征模型制備

第三腰椎橫突綜合征模型制備方法參照王健瑞等[5]造模方法，操作如下：按照3 mL/kg體質(zhì)量使用10%水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉，俯臥位固定四肢，腰背部局部剪毛備皮，醫(yī)用酒精擦拭消毒，取大鼠腰背部L3-L4棘突旁約0.6 cm處，縱向切口2 cm，由淺入深地向兩側(cè)剝離骸棘肌，顯露第三腰椎橫突，用微型骨科器械緩慢剝離第三腰椎橫突周圍組織(操作要仔細(xì)，避免傷及腰部神經(jīng))，完整分離腰椎深筋膜脊神經(jīng)后支穿出部分，將0.5×0.5 cm大小的明膠海綿置于L3橫突處，縫合骶棘肌筋膜和皮膚切口，使用慶大霉素注射液(7.5 mg/kg)反復(fù)沖洗切口防止感染。模型組、藥物組、內(nèi)熱針組、普通針刺組和溫針灸組大鼠均采用此法制備第三腰椎橫突綜合征模型，對照組大鼠不做任何處理。

1.4 分組治療

造模2周后對各組大鼠進(jìn)行分組治療。正常組不做任何處理；模型組不接受治療但進(jìn)行常規(guī)麻醉；藥物組混合藥物由得寶松(0.6 mg/kg)+甲鈷胺(0.1 mg/kg)+羅哌卡因(0.9 mg/kg)組成，常規(guī)麻醉后定點注射至第三腰椎損傷位置，每3 d 1次，每周2次共4周；內(nèi)熱針組常規(guī)麻醉固定，腰部皮膚消毒，用10 cm長的內(nèi)熱針從第三腰椎平行的方向刺入損傷組織內(nèi)2 cm，43 ℃恒溫加熱20 min，每周1次共4周；普通針刺組常規(guī)麻醉固定，腰部皮膚消毒，用0.35 mm×40 mm毫針對第三腰椎平行肌損傷組織進(jìn)行治療，穿刺方法與內(nèi)熱針一致，每周1次共4周；溫針組取穴、進(jìn)針操作同普通針刺組，將艾條套入針尾點燃，至艾灸燃盡為止，每周1次共4周。

1.5 血清炎性細(xì)胞因子檢測

治療周期結(jié)束后麻醉固定大鼠，從鎖骨中間位置進(jìn)針采取大鼠頸靜脈取血4 mL，加入0.2 mL抗凝劑EDTA·Na2混勻，靜置30 min，3500 r/min，離心15 min取上清待檢。采用ELISA法檢測大鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量，實驗操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書執(zhí)行。

1.6 HE染色

取血后采用斷頸法處死各組大鼠，取第三腰椎橫突造模處肌肉組織(正常組取相應(yīng)部位肌肉)，經(jīng)過4%福爾馬林固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，65 ℃烤片。將組織切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精液染色，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察組織病理學(xué)變化。

1.7 Western blot檢測

取各組大鼠第三腰椎橫突造模處肌肉組織(正常組取相應(yīng)部位肌肉)，加入液氮磨碎，添加RIPA裂解液提取組織蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。取25μg蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE，并將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF)上，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗p-Akt(S473)(1∶1000)、NF-κB(p65)(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)后4 ℃孵育過夜，洗滌后滴加HRP標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG(1∶10000)室溫孵育30 min，洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光液孵育1 min，使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)熱針治療對損傷組織病理學(xué)的影響

圖1 治療后各組大鼠第三腰椎橫突處肌肉組織HE染色(200×)

注：與正常組比較：###P<0.001；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001圖2 各組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平比較

圖1示，正常組大鼠第三腰椎橫突處肌肉組織結(jié)構(gòu)正常，肌纖維排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組可見肌纖維斷裂、排布混亂，且有大量組織壞死和少量炎性細(xì)胞浸潤；內(nèi)熱針組與藥物組肌纖維排列整齊，偶見炎性細(xì)胞；普通針刺組肌纖維排列松散，有少量炎性細(xì)胞浸潤和組織壞死；溫針灸組肌纖維排列不規(guī)則，有部分細(xì)胞壞死和少量炎性細(xì)胞浸潤。

2.2 內(nèi)熱針治療對炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量的影響

圖2示，與正常組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量均顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，藥物組、內(nèi)熱針組、溫針灸組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量均顯著降低(P<0.05)，普通針刺組大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-8含量均顯著降低(P<0.05)，且內(nèi)熱針組最為顯著(P<0.01)。

2.3 內(nèi)熱針治療對大鼠損傷組織中p-Akt(S473)和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)的影響

圖3示，與正常組比較，模型組損傷組織中p-Akt(S473)和NF-κB(p65)蛋白均出現(xiàn)高表達(dá)(P<0.001)；與模型組比較，各治療組p-Akt(S473)和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)則出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05)，且內(nèi)熱針組下調(diào)最為明顯(P<0.001)。

注：與正常組比較：###P<0.001；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001圖3 Western blot 檢測損傷組織中p-Akt(S473)和NF-κB(p65)蛋白表達(dá)水平

3 討論

第三腰椎橫突綜合征屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，主要是因腰部勞損、筋膜增厚、黏連對腰脊神經(jīng)后外側(cè)支產(chǎn)生卡壓，導(dǎo)致腰、臀部酸痛及腰部活動受限，是臨床引起腰腿痛的常見病因之一。臨床行X線檢查一般不會發(fā)現(xiàn)異常，且偏向于保守治療。有研究表明[6]，第三腰椎橫突綜合征損傷組織產(chǎn)生的炎癥會導(dǎo)致以白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和活化的小膠質(zhì)細(xì)胞為主的細(xì)胞滲出，以及血管通透性的增加，促炎因子的釋放。組織中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞或活化的小膠質(zhì)細(xì)胞滲出后，將聚集到炎癥部位并釋放TNF-α、IL-6、IL-1β、組胺和TGF-β等活性介質(zhì)，進(jìn)一步加重局部組織的損傷作用[7]。因此，第三腰椎橫突綜合征又稱腰三橫突周圍炎或腰三橫突滑膜炎。

實踐已證實，內(nèi)熱針在腰突癥、腰椎管狹窄、頑固性腰腿疼、各型頸椎病、肩周炎等軟組織損傷疾病的治療中療效顯著[8-9]。有研究稱，內(nèi)熱針針體溫度較集中，能夠迅速傳遞到周圍的肌肉及軟組織中，從而促進(jìn)局部血液循環(huán)，降低肌肉張力，具有減輕無菌性炎癥的作用[4]。李曉泓等[10]采用明膠海綿植入法建立第三腰椎橫突綜合征后也發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子含量的顯著升高。本研究結(jié)果也顯示，第三腰椎橫突綜合征模型大鼠血清中促炎因子含量升高，且損傷組織中炎癥反應(yīng)嚴(yán)重，而通過內(nèi)熱針、普通針刺、溫針灸和藥物治療后，大鼠血清中炎性細(xì)胞因子水平下降，組織損傷得到修復(fù)，說明針刺或針灸治療能有效改善第三腰椎橫突綜合征的炎癥反應(yīng)，而內(nèi)熱針憑借其獨特的工藝設(shè)計達(dá)到了最好的治療效果。

有研究表明[11-12]，磷酸化的Akt能夠激活I(lǐng)κB激酶，使IκB與NF-κB解離，形成具有活性的NF-κB p65亞基，使其進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。因此，推測內(nèi)熱針治療改善第三腰椎橫突綜合征炎癥反應(yīng)的機制可能是通過抑制Akt/NF-κB信號通路實現(xiàn)的。本研究結(jié)果提示，Akt/NF-κB信號通路在第三腰椎橫突綜合征模型中處于激活狀態(tài)。而經(jīng)過治療后，p-Akt(S473)、NF-κB(p65)蛋白則出現(xiàn)下調(diào)，說明內(nèi)熱針治療抑制了Akt/NF-κB信號通路的激活。綜上所述，內(nèi)熱針治療可通過抑制Akt/NF-κB信號通路的激活，改善第三腰椎橫突綜合征的炎癥反應(yīng)。