肖 寒，方乃青，奚柯婧，秦 艷，李慧剛

(1. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214062； 2. 江蘇省無錫市錫山區(qū)查橋社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，江蘇 無錫 214062)

中國是肝癌高發(fā)地區(qū)，GLOBOCAN 2012統(tǒng)計(jì)顯示，全世界50%的肝癌發(fā)生于中國，高發(fā)區(qū)主要集中在江蘇、浙江、福建等東南沿海地區(qū)[1]。由于臨床癥狀不典型，發(fā)現(xiàn)時中晚期患者居多，且肝癌對放化療不敏感，治療手段較少，預(yù)后差[2]?！袄钍媳≠N”是經(jīng)四代醫(yī)者100多年的共同努力，參照唐代《千金翼方》中的有關(guān)處方，遵循中醫(yī)學(xué)辨證與辨病相結(jié)合的原則，在民間秘方“消腫止痛膏”的基礎(chǔ)上不斷完善、創(chuàng)新發(fā)展起來的外用方劑，在2010年被無錫市人民政府批準(zhǔn)為非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護(hù)項(xiàng)目。主要由中藥莪術(shù)、參三七、山慈菇、大黃等4味藥物組成。在臨床應(yīng)用中，使許多原發(fā)性肝癌患者能控制腫瘤，減輕痛苦，緩解癥狀，延長生命，提高生活質(zhì)量。本研究應(yīng)用動物模型對“李氏薄貼”的抗肝癌作用機(jī)制進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)藥物

“李氏薄貼”外用膏藥由“李氏薄貼”傳承人李慧剛配制。藥物組成：山慈菇8 g，莪術(shù)8 g，參三七5 g，大黃5 g，購自江南大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，并由藥房加工成100目的藥粉，按照1∶2的比例將藥粉與黑藥肉混合加熱至60°，涂于塑料薄膜上固定成外用膏藥，切制成2×2 cm外用膏藥，低劑量組每張2×2 cm膏藥含生藥量0.3 g(折算成實(shí)驗(yàn)小鼠用量為15 g/kg)，高劑量組每張2×2 cm膏藥含生藥量0.6 g(折算成實(shí)驗(yàn)小鼠用量為30 g/kg)。氟尿嘧啶注射液由天津金耀藥業(yè)有限公司提供(批號H12020959)。

1.2 動物

SPF級昆明種小鼠46只，其中雌雄各23只，20只雌性以及20只雄性小鼠分組供實(shí)驗(yàn)用，另6只小鼠供H22瘤株傳代用，每只小鼠重約 (20±2) g，購自江南大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號SYXK(蘇)2016-0044)。在江南大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于溫度18～22 ℃、濕度50%～60%環(huán)境中，給予自由攝食和飲水，提供消毒普通顆粒飼料。

1.3 細(xì)胞系

小鼠肝癌 H22 細(xì)胞株，購自上海酶研生物科技有限公司。

1.4 試劑及儀器

TUNEL法細(xì)胞凋亡試劑盒(批號MK1020)、一抗Bcl-2(批號BM4985)、一抗Bax(批號BA0315-1)及一抗Caspase-3(批號BM4620)均購于武漢博士德生物工程有限公司；蘇木素-伊紅染液(武漢谷歌生物科技有限公司)；OLYMPUS BX43雙目生物攝像顯微鏡(日本)；JJ-12 J 型脫水機(jī)、包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM2013 病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(上海研卉生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 H22肝癌小鼠模型的制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行造模[3]，首先進(jìn)行H22肝癌細(xì)胞株復(fù)蘇、培養(yǎng)擴(kuò)增，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至1×107個/ml，抽取上述細(xì)胞懸液0.2 ml注入6只昆明種小鼠腹腔，7 d后抽取腹水，將腹水離心(1200 r/min 5 min)后留取下層含細(xì)胞液體。

除模型對照組外，其他3組小鼠在術(shù)前禁食12 h，手術(shù)前20 min使用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，劑量為 3.5 ml/kg。在無菌操作臺上，將麻醉后的小鼠仰臥位固定于手術(shù)板，沿腹正中線逐層切開，手術(shù)切口1 cm左右暴露肝臟，用1 ml 注射器抽取含H22肝癌細(xì)胞液體，針頭斜刺入肝臟，注入0.05 ml逐層縫合關(guān)腹，仔細(xì)觀察小鼠術(shù)后恢復(fù)情況，4 d后開始用藥。

2.2 給藥方法

將40只荷瘤小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對照組、陽性對照組、低劑量組、高劑量組4組各10只，腹部皮膚表面脫毛處理。其中低劑量組、高劑量組將“李氏薄貼”外用膏藥貼敷于腹部肝區(qū)，每3 d更換，連續(xù)9 d。陽性對照組給予氟尿嘧啶注射液浸潤的2×2 cm膠布外貼(內(nèi)層為含氟尿嘧啶注射液紗布)，每日1次，連續(xù)9 d。模型對照組給予0.9 %氯化鈉外用，每日1次，連續(xù)9 d。9 d后處死小鼠，切取肝臟腫瘤組織稱重。計(jì)算抑瘤率：抑瘤率=(模型對照組腫瘤質(zhì)量-藥物組腫瘤質(zhì)量)/模型對照組腫瘤質(zhì)量×100%。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 HE染色觀察細(xì)胞學(xué)形態(tài) 使用10%中性甲醛溶液將小鼠肝臟腫瘤組織固定12 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，烘箱內(nèi)烘干，使用HE染色法染色，光鏡下觀察細(xì)胞學(xué)形態(tài)。

2.3.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 使用二甲苯對石蠟切片進(jìn)行2次脫蠟各5～10 min，按順序放入無水乙醇5 min。接著放入90%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各2 min，3%過氧化氫甲醇中浸洗10 min。滴加20 μg/ml蛋白酶K，在室溫下孵育20 min。PBS洗滌5 min，連續(xù)3次。滴加50 μl的TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃孵育60 min。PBS洗滌3次，每次5 min×3次，加入50 μl轉(zhuǎn)化劑POD后在濕盒中37 ℃孵育25 min。PBS沖洗后加入50 μlDAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，中性樹膠封片后光鏡下分析結(jié)果。陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒，每個視野計(jì)數(shù)200個細(xì)胞，每個實(shí)驗(yàn)組選取10個視野，按照公式：凋亡指數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

2.3.3 免疫組化方法檢測腫瘤組織中Bax(Bcl-2基因相關(guān)蛋白X)、Caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3)、Bcl-2(B細(xì)胞性淋巴瘤/白血病-2基因)的表達(dá)情況 免疫組化檢測使用SP三步法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。石蠟包埋的腫瘤組織切片、脫蠟水化，PBS緩沖液沖洗后利用微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后加3%H2O2室溫下孵育。PBS沖洗后加入一抗，經(jīng)孵育沖洗后加入二抗，DAB 染色，蘇木素復(fù)染后常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒或棕褐色顆粒細(xì)胞為陽性細(xì)胞。采用圖像處理分析軟件Image-Pro Plus 6.0對Bax、Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)進(jìn)行定量分析，計(jì)算并得出平均光密度值(IOD/Area)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠抑瘤率分析

表1圖1示，“李氏薄貼”低劑量組以及高劑量組和模型對照組比較，腫瘤組織質(zhì)量均有降低，其中高劑量組和模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與使用氟尿嘧啶陽性對照組比較，高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明高劑量組與氟尿嘧啶一樣能抑制腫瘤生長，而“李氏薄貼”低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明低劑量組抑制腫瘤生長效果欠佳?！袄钍媳≠N”高劑量組、低劑量組抑瘤率分別為38.97%、13.47%，提示“李氏薄貼”可抑制腫瘤生長，其中高劑量組效果較好。

表1 各組小鼠瘤重與抑瘤率分析比較

3.2 HE染色結(jié)果

圖2示，模型對照組的病理切片中，藍(lán)色的為染色后的細(xì)胞核，紅色為細(xì)胞漿，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)多邊形，核較正常細(xì)胞大且形態(tài)各異，可見較多的核分裂，核漿比例失調(diào)，毛細(xì)血管豐富，部分區(qū)域存在壞死組織，說明肝癌細(xì)胞生長迅速?！袄钍媳≠N”高劑量組圖中可見，細(xì)胞漿腫脹呈空泡狀，細(xì)胞核固縮、壞死，毛細(xì)血管數(shù)量明顯減少，血管腔變細(xì)，說明腫瘤細(xì)胞有一定程度的凋亡?！袄钍媳≠N”低劑量組圖中可見少量細(xì)胞漿呈空泡狀，少量細(xì)胞核固縮、壞死，說明腫瘤細(xì)胞凋亡程度較輕。陽性對照組與高劑量組相類似，細(xì)胞漿腫脹明顯，可見到大量細(xì)胞核固縮、壞死，說明細(xì)胞凋亡程度高。

3.3 TUNEL檢測結(jié)果

圖2B組圖片示，光鏡下發(fā)現(xiàn)模型對照組幾乎沒有陽性細(xì)胞(細(xì)胞核顯棕黃色的凋亡細(xì)胞)，細(xì)胞排列緊密呈藍(lán)色，低劑量組偶可見陽性細(xì)胞，而陽性對照組以及高劑量組出現(xiàn)大量棕黃色陽性細(xì)胞。表2示，通過凋亡指數(shù)的統(tǒng)計(jì)，與陽性對照組比較，低劑量組凋亡指數(shù)處于低水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而高劑量組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與模型對照組比較，低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但高劑量組凋亡指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明高劑量組和化療藥物氟尿嘧啶一樣具有較強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用，而低劑量組促細(xì)胞凋亡作用較弱。

3.4 腫瘤組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)差異

表2圖4示，與模型對照組比較，“李氏薄貼”高劑量組Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，無論是“李氏薄貼”高劑量組還是低劑量組Bax、Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)都是顯著增加，其平均光密度值(IOD/Area)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。與陽性對照組比較，“李氏薄貼”低劑量組Bax、Caspase-3表達(dá)水平明顯下降，Bcl-2表達(dá)水平增加(P<0.05)，而“李氏薄貼”高劑量組與陽性對照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明高劑量組引起細(xì)胞凋亡程度與陽性對照組相當(dāng)，而低劑量組由于劑量的關(guān)系，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)程度與陽性對照組比較還有一定差異。這一結(jié)果提示“李氏薄貼”可以通過降低抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，提高促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)以達(dá)到促進(jìn)肝癌細(xì)胞線粒體途徑凋亡，且具有一定的量效關(guān)系。

表2 各組小鼠凋亡指數(shù)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)差異比較

4 討論

“李氏薄貼”由莪術(shù)、參三七、山慈菇、大黃、大戟等數(shù)十味主要藥物組成，其中山慈菇、莪術(shù)、參三七3味為主要藥物。山慈菇的功效為清熱解毒，消癰散結(jié)，在臨床上主要用于治療癰腫、瘰疬、疔毒、淋巴結(jié)核等[4]。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇的提取物對結(jié)腸癌(HCT-8)、肝癌(Be17402)、胃癌(BGC-823)、肺癌(A549)、乳腺癌(MCF-7)和卵巢癌(A2780)細(xì)胞表現(xiàn)出非選擇性中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性，能有效抑制血管內(nèi)皮祖細(xì)胞管腔形成和細(xì)胞遷移，它是一種新的抗血管生成抑素，應(yīng)用于血管增生性視網(wǎng)膜病變和腫瘤的治療[5]。莪術(shù)油是常用的抗腫瘤中藥材莪術(shù)的提取物，它可以促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制為上調(diào)凋亡相關(guān)bax基因，以及下調(diào)bcl-2基因，促凋亡作用與濃度以及時間成正比[6-7]。三七總皂苷是一種多靶點(diǎn)抗腫瘤中藥，其特點(diǎn)是高效低毒，也就是說它對正常組織細(xì)胞毒性低，對腫瘤細(xì)胞毒性高，有直接殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多重機(jī)制抗腫瘤[8]。由此可見，“李氏薄貼”的主要成分均具有一定的抗腫瘤作用。

細(xì)胞凋亡存在兩條主要信號通路[9-12]，一條為內(nèi)在的線粒體通路和另一條為外在的死亡受體信號通路。在線粒體通路中，當(dāng)?shù)蛲龃碳ひ蛩刈饔孟?，可引起線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素c從線粒體

釋放入胞質(zhì)，引發(fā)caspases級聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。其中，bcl-2家族蛋白是在線粒體凋亡通路中起重要調(diào)控作用的一類蛋白。Bcl-2家族蛋白按功能可分為促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡兩大類成員，即具有抑制凋亡作用的蛋白有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等，具有促進(jìn)凋亡作用的有Bax、Bd-Xs等。胞外的死亡信號可通過Fas等死亡受體轉(zhuǎn)入胞內(nèi)[13-14]。Fas是細(xì)胞表面重要的死亡受體，細(xì)胞在接收到經(jīng)Fas傳遞的凋亡信號后，可以通過Fas I型通路和Fas II型信號通路引發(fā)細(xì)胞凋亡。Fas受體介導(dǎo)的caspase-8的量不足以直接激活凋亡執(zhí)行酶caspase-3。因此這類細(xì)胞中的凋亡信號需要借助凋亡的線粒體通路來放大，線粒體為啟動下游的凋亡執(zhí)行環(huán)節(jié)caspase級聯(lián)反應(yīng)提供放大信號。外源性和內(nèi)源性凋亡途徑最終都依賴caspase-3的激活，它是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性執(zhí)行分子，caspase-3一旦被激活細(xì)胞凋亡則不可避免。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，“李氏薄貼”高劑量組能抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，在光鏡下有細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，其凋亡指數(shù)高于低劑量組，與陽性對照組相當(dāng)，說明“李氏薄貼”能通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡而起到抑制肝癌的作用。但它是通過什么途徑發(fā)揮作用的呢？進(jìn)一步利用免疫組化方法對腫瘤組織進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織Bax、Caspase-3表達(dá)上調(diào)、Bcl-2下調(diào)，推測該藥是通過增加Bax及Caspase-3的表達(dá)、抑制Bcl-2的表達(dá)來發(fā)揮抑瘤效應(yīng)的。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果恰好說明“李氏薄貼”的作用機(jī)制與線粒體途徑引起肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)。下一步研究將進(jìn)一步對“李氏薄貼”從分子及基因水平驗(yàn)證其作用機(jī)制是否存在其他作用途徑，為產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。