石勇，霞曉燕

(綿陽市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 綿陽 621000)

急性脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)多由直接暴力引起，包括交通事故傷、高處跌落傷等，具有創(chuàng)傷大、預(yù)后差的特點(diǎn)[1-2]。既往文獻(xiàn)報(bào)道，急性SCI往往導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的壞死和凋亡，而干細(xì)胞移植是一種有效的治療方案[3-4]。但是，也有研究表明，干細(xì)胞移植具有分化程度低、易老化的特點(diǎn)[5]。因此，尋找一種有效的干細(xì)胞促分化方案，有效抑制干細(xì)胞的老化具有重要的意義。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)是一種常見的神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元的分化和神經(jīng)纖維的定向生長的作用[6-7]。本研究利用Cas-9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建NGF的基因過表達(dá)載體，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)。并且通過構(gòu)建大鼠的脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)動(dòng)物模型，注射處理后的BMSCs，利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)、Western blot、免疫熒光等方法檢測NGF的表達(dá)和神經(jīng)的修復(fù)，以期為臨床上急性脊髓損傷的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清購自以色列BI公司；改良Eagle培養(yǎng)基(dulbecco's modification of eagle's medium，DMEM)及0.25%胰酶Trypsin購自美國Invitrogen公司；TRIZOL購自美國Invitrogen公司；氯仿、酒精及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA公司；電泳儀、Real-time熒光定量PCR儀購自美國bio-rad公司。無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級SD大鼠購自濟(jì)南齊魯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(魯)2018-2892]。月齡6～7個(gè)月，體重398～412 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人BMSCs的分離和培養(yǎng) 選取10名健康志愿者，男性6例，女性4例；年齡19～25歲，平均(22.13±3.23)歲。實(shí)驗(yàn)方案獲得了本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有志愿者均簽署知情同意書。骨髓穿刺針提取志愿者的新鮮骨髓，按照1︰3體積比加入含0.01 mol/L的胎牛血清、100 U/mL青霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，充分混勻后，移入25 cm2Hank培養(yǎng)瓶中。差速培養(yǎng)法培養(yǎng)，3 d后去掉培養(yǎng)瓶中的油脂等雜質(zhì)，之后每3天更換1次細(xì)胞培養(yǎng)液。BMSCs細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 BMSCs的鑒定 采用流式細(xì)胞儀檢測BMSCs的表面蛋白，CD 29、CD 44、CD 71、CD 90和CD 106等表面蛋白的表達(dá)可以為BMSCs的鑒定提供依據(jù)。另外，采用倒置光學(xué)顯微鏡也可以觀察BMSCs的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 慢病毒NGF過表達(dá)載體的構(gòu)建 利用Pubmed基因庫數(shù)據(jù)平臺(tái)，篩選人源性NGF的基因序列，基因序列為NC_000001.11，基因ID：4803，選擇pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作為質(zhì)粒的克隆載體。NGF過表達(dá)載體的克隆切入點(diǎn)是XhoI/BamHI，編號(hào)為ENST00000005188。

1.2.4 SD大鼠急性SCI動(dòng)物模型構(gòu)建 利用鉗夾法[8]構(gòu)建大鼠SCI模型，SD大鼠采取腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉滿意后取俯臥位，常規(guī)消毒，備皮。取后背正中切口，逐層分離皮膚、筋膜和肌肉，直達(dá)棘突，盡量咬除T9～11棘突和椎弓板，暴露T10脊髓，將動(dòng)脈瘤夾放置在脊髓上，寬度為脊髓的一半，突然釋放夾子使脊髓受到暴擊，30 s后取下動(dòng)脈瘤夾，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗，逐層縫合(見圖1)。

圖1 脊髓損傷模式圖和大體圖片

1.2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 根據(jù)轉(zhuǎn)染的BMSCs類型，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分成三組，每組5只SD大鼠。模型組：SD大鼠均未做任何處理；BMSCs組：SD大鼠SCI模型構(gòu)建后，注射無慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs；過表達(dá)質(zhì)粒組：SD大鼠SCI模型構(gòu)建后，注射NGF過表達(dá)質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 行為學(xué)觀察 三組SD大鼠均在損傷前和處理后12 h進(jìn)行后肢功能恢復(fù)的行為學(xué)檢測，以運(yùn)動(dòng)功能(basso-beattie-bresnahan，BBB)評分作為指標(biāo)，觀察指標(biāo)為小鼠后肢踝關(guān)節(jié)活動(dòng)度、腳掌腳背著地情況、軀干穩(wěn)定性及尾巴的位置。

1.3.2 RT-PCR檢測NGF和凋亡標(biāo)志因子Caspase-3的表達(dá) 各組大鼠干預(yù)2周后均按照動(dòng)物倫理的要求無痛苦處死，取1 g修復(fù)的脊髓組織，加入1 mL Trizol試劑，充分研磨，抽提總RNA，然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)TaKaRa熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒說明書的要求，采用20 μL的反應(yīng)體系，加入各樣品，進(jìn)行熒光定量PCR的檢測。內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和NGF、Caspase-3引物由上海生工公司生產(chǎn)(見表1)。采用2-ΔΔCT的方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 目的基因的引物序列

1.3.3 Western blot檢測NGF和凋亡標(biāo)志因子Caspase-3的表達(dá) 各組大鼠干預(yù)2周后均按照動(dòng)物倫理的要求無痛苦處死，取1g修復(fù)的脊髓組織，加入1 mL放射免疫沉淀法緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)裂解液，冰上裂解30 min，收集入1.5 mL的離心管中，在預(yù)冷4℃的離心機(jī)中離心，預(yù)設(shè)：5 000 r/min，5 min后提取上清，經(jīng)95℃煮沸后收集蛋白備用。按照說明書制備濃縮膠10 mL，分離膠20 mL。上樣后電泳分離，轉(zhuǎn)膜后在4℃冰箱避光孵育過夜(>12 h)。NGF和Caspase-3一抗經(jīng)一抗稀釋液1︰10 000稀釋后加入樣本離子膜。第2天用含吐溫20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution tween，PBST)稀釋液洗膜，重復(fù)3次，加用山羊抗小鼠1 g G二抗經(jīng)二抗稀釋液1︰1 000稀釋后孵育二抗1.5 h，用PBST稀釋液洗膜，重復(fù)3次，而后用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯影液處理樣本。Image J軟件可以用來分析蛋白條帶。

1.3.4 免疫熒光染色檢測NGF的定位表達(dá) 各組大鼠干預(yù)2周后均按照動(dòng)物倫理的要求無痛苦處死，取1 g修復(fù)的脊髓組織，制備石臘組織，冰凍切片，二甲苯梯度處理，PBS溶液清洗后檸檬酸溶液浸潤20 min，PBS溶液清洗3次，BSA孵育30 min，避光孵育神經(jīng)纖維標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)元細(xì)胞核(neuronal nuclei，NeuN)蛋白一抗，4℃避光孵育過夜。PBS溶液清洗3次，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗避光孵育30 min，PBS溶液清洗3次，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 人BMSCs的培養(yǎng)和鑒定 原代BMSCs細(xì)胞成梭形或者多角形；培養(yǎng)至第2代后，呈旋渦狀或者輻射狀生長；流式細(xì)胞儀檢測第2代BMSCs的表面蛋白，CD 44和CD 29的表達(dá)為60.2%和58.3%；CD 34和CD 45的表達(dá)為3.4%和2.6%(見圖2)。

a 原代BMSCs b 第2代BMSCs

c 表面蛋白CD44的表達(dá) d 表面蛋白CD29的表達(dá)

e 表面蛋白CD34的表達(dá) f 表面蛋白CD45的表達(dá)

2.2 NGF過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染效率=熒光視野下細(xì)胞數(shù)/白光視野下細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染效率為90%以上，轉(zhuǎn)染效率較高(見圖3)。

a 白光下視野 b 瑩光下視野

2.3 行為學(xué)檢測 術(shù)前SD大鼠BBB評分(21.91±4.7)分，分，模型組術(shù)后1 d的BBB評分降至最低，而BMSCs組要高于模型組(F=9.898，P<0.05)，過表達(dá)質(zhì)粒組高于模型組和BMSCs組(q值分別為2.198和2.004，P<0.05)。術(shù)后3 d的BBB評分明顯回升，術(shù)后12 d與術(shù)后14 d較平緩，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖4a)。

后肢踏空率的比較中，BMSCs組要明顯高于模型組(F=9.077，P<0.05)，過表達(dá)質(zhì)粒組要明顯高于模型組和BMSCs組(q值分別為2.129和2.099，P<0.05，見圖4b)。

a 三組小鼠的BBB評分 b 三組小鼠的后肢踏空率

2.4 NGF和凋亡信號(hào)分子Caspase-3的表達(dá)量 RT-PCR結(jié)果顯示，BMSCs組NGF mRNA的相對表達(dá)水平要明顯高于模型組(F=8.997，P<0.05)，過表達(dá)質(zhì)粒組NGF mRNA的相對表達(dá)水平要明顯高于模型組和BMSCs組(q值分別為2.971和1.2.099，P<0.05)。Western blot的結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相同(見圖5)。

a NGF mRNA的相對表達(dá)水平 b Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)水平

c Western blot檢測結(jié)果 d 蛋白的灰度值

2.5 免疫熒光染色結(jié)果 結(jié)果顯示，過表達(dá)質(zhì)粒組脊髓修復(fù)程度要優(yōu)于BMSCs組和模型組。可見斷裂間距明顯縮小，斷端修復(fù)較好(見圖6～7)。

圖6 脊髓標(biāo)本的GFAP染色結(jié)果(免疫熒光染色，×800)

圖7 增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP和GFAP共染結(jié)果(免疫熒光染色，×600)

2.6 NGF與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN共染結(jié)果 過表達(dá)質(zhì)粒組NGF可與NeuN共染，神經(jīng)元細(xì)胞量增多(見圖8)。

圖8 NGF與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN共染結(jié)果(免疫熒光染色，×600)

3 討 論

本研究通過構(gòu)建NGF的過表達(dá)載體，通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染人BMSCs。并且利用鉗夾法構(gòu)建SD大鼠的脊髓損傷動(dòng)物模型，接種NGF過表達(dá)載體修飾后的BMSCs，利用RT-PCR和Western blot進(jìn)行定量檢測，表明過表達(dá)載體組脊髓組織中可見NGF的過表達(dá)和凋亡標(biāo)志因子Caspase-3的低表達(dá)。說明NGF基因過表達(dá)載體可以抑制脊髓組織神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。另外，通過免疫熒光定位檢測，可見NGF蛋白可以與神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志蛋白NeuN共染，與神經(jīng)膠質(zhì)纖維標(biāo)志蛋白GFAP不共染。說明NGF過表達(dá)載體可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞元的增殖，進(jìn)一步促進(jìn)脊髓的修復(fù)。而且，我們也通過行為學(xué)檢測，利用BBB評分和后肢踏空率對動(dòng)物的行為進(jìn)行評估，結(jié)果表明，NGF過表達(dá)載體組小鼠的行為較另外兩組明顯改善。利用干細(xì)胞的多分化潛能對急性SCI進(jìn)行治療一直是骨科研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題[9-10]。Zhao等[11]將BMSCs細(xì)胞接種于急性SCI損傷動(dòng)物模型中，得到良好的治療效果，但是也存在一些問題，比如干細(xì)胞的不定性分化和易老化等。這些問題限制的干細(xì)胞在脊髓修復(fù)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。陳乃耀等[12]利用人源臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)大鼠模型，結(jié)果證明，人源臍血間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)TBI大鼠模型的神經(jīng)損傷程度的改善，有利于損傷腦組織的修復(fù)。從而說明，可以利用人源性干細(xì)胞治療大鼠模型，具有良好的兼容性和有效性。既往文獻(xiàn)報(bào)道，NGF可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化，并且抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[11]。本研究在前人的基礎(chǔ)上，采用Cas-9技術(shù)，篩選NGF的基因，通過擴(kuò)增基因序列，促進(jìn)NGF的蛋白表達(dá)，借助慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將NGF過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人源BMSCs，可以促進(jìn)干細(xì)胞的定向分化，抑制凋亡。通過RT-PCR和Western blot等方法檢測NGF和凋亡標(biāo)記因子Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果表明，NGF轉(zhuǎn)染后可以抑制凋亡。原因可能與NGF的過度表達(dá)有關(guān)。并且利用免疫熒光染色定位NGF與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN的共染，結(jié)果表明，NGF過表達(dá)質(zhì)?？梢源龠M(jìn)NeuN的表達(dá)，說明NGF可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化。其原因可能與NGF的促神經(jīng)元分化相關(guān)。而且，既往文獻(xiàn)中也對空白質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行了相應(yīng)研究，他們的研究結(jié)果表明空白質(zhì)粒對研究結(jié)果無影響，結(jié)果說明空白質(zhì)粒不會(huì)影響研究結(jié)果[13-14]。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相同，空白質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，不會(huì)影響B(tài)MSCs的分化和增殖。

為了進(jìn)一步評估NGF過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后對SCI動(dòng)物模型脊髓損傷的修復(fù)作用，本研究還利用免疫熒光染色共染神經(jīng)膠質(zhì)纖維標(biāo)志蛋白GFAP，結(jié)果表明，過表達(dá)質(zhì)粒組脊髓修復(fù)程度要優(yōu)于BMSCs組和模型組?？梢姅嗔验g距明顯縮小，斷端修復(fù)較好。而且通過行為學(xué)檢測，利用BBB評分和后肢踏空率對動(dòng)物的行為進(jìn)行評估，結(jié)果表明，NGF過表達(dá)載體組小鼠的行為較另外兩組明顯改善。其原因可能為神經(jīng)元的增殖，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)纖維的生成，從而對脊髓組織起到很好的修復(fù)效果，進(jìn)一步影響SCI動(dòng)物模型的行為。

綜上所述，NGF過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可以促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化，促進(jìn)SCI動(dòng)物模型的功能恢復(fù)。