孫沙沙，李玉華

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響患者的身心健康，甚至危及生命［1，2］。目前，子宮內(nèi)膜癌的治療雖然取得了較大進(jìn)展，但其預(yù)后較差且5年生存率＜40%［3］。因此，尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)功能［4-6］，與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn) miR-142-3p在乳腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種癌癥中表達(dá)降低，可參與抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等過(guò)程［7-10］。有研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)顯著降低［11］，提示miR-142-3p可能是診斷治療子宮內(nèi)膜癌的一個(gè)重要靶點(diǎn)。筆者通過(guò)上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞miR-142-3p的表達(dá)，探究miR-142-3p對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系（Ishikawa和HEC-1A）和正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞系（HEC-251）（中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）。Lipofectamine 3000和Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），MTT試劑盒 （北京 solaibio公司），Tranwell小室（美國(guó) Corning公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)試劑盒（日本TaKaRa公司），MMP-2和MMP-9一抗（美國(guó)Cell Signal公司），miR-142-3p mimics及相關(guān)引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ishikawa，HEC-1A和HEC-251細(xì)胞。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別將miR-142-3p mimics及其陰性對(duì)照（miR-NC）利用 Lipofectamine 3000試劑盒法瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HEC-1A，分為3組：空白對(duì)照組（Control）、陰性對(duì)照組（miR-NC）、miR-142-3p過(guò)表達(dá)組（miR-142-3p mimics）。

1.2.3 MTT法 將轉(zhuǎn)染后的HEC-1A細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種4×103個(gè)細(xì)胞。于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 0h、24h、48h、72h、96 h 后，每孔加 20 μL MTT 液（5 mg/ml）呈色。 繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去培養(yǎng)液。隨后，每孔加入DMSO（150 μl），避光孵育 10 min。 酶標(biāo)儀測(cè)定各組HEC-1A細(xì)胞在490 nm處的OD值。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染的HEC-1A細(xì)胞置于以Matrigel基底膠包被或不包被的Transwell小室上室、下室中加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用棉簽擦去上室面上的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色15 min，隨機(jī)取6個(gè)視野顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè) 采用Trizol試劑抽提總RNA。經(jīng)微量核酸定量?jī)x測(cè)定RNA濃度和純度后，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用ABI7500定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 34 s，40 個(gè)循環(huán)。以 U6 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中miR-142-3p的相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)如下：miR-142-3p F：5’-GGGTGTAGTGTTTCCTACT-3’，R：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6 F：5’-TGCGGGTGCTCCGCTTCGGCAGC-3’，R：5’-CAG TGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 蛋白樣品按照 50 μg/孔上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后、電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉PBST溶液封閉后，加入一抗（MMP-2，1∶1000；MMP-9，1∶1000；β-actin，1∶1000）4℃孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果以（±s）表示，使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-142-3p在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中低表達(dá)qRT-PCR結(jié)果表明，與HEC-251細(xì)胞比較，miR-142-3p在Ishikawa細(xì)胞尤其是HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）（圖 1）。因此，選 HEC-1A 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 1qRT-PCR 檢測(cè) miR-142-3p在HEC-251、Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)與HEC-251比較（＊P＜0.05）

2.2 miR-142-3p mimics增加HEC-1A細(xì)胞中miR-142-3p的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p轉(zhuǎn)染后HEC-1A細(xì)胞中miR-142-3p的表達(dá)水平明顯高于Control組和miR-NC組 （P＜0.05）（圖2）。證明miR-142-3p被成功轉(zhuǎn)入HEC-1A細(xì)胞中。

圖2qRT-PCR檢測(cè)miR-142-3p在各組HEC-1A細(xì)胞中的表達(dá)與Control組和miR-NC組比較（＊P＜0.05）

2.3 miR-142-3p過(guò)表達(dá)抑制HEC-1A細(xì)胞增殖MTT實(shí)驗(yàn)表明，與Control組和miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染 24 h、48 h、72 h 及 96 h 后，miR-142-3p 組HEC-1A細(xì)胞的吸光度值顯著降低 （P＜0.05）（圖3），表明miR-142-3p過(guò)表達(dá)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A的增殖。

圖3見(jiàn)封三。

圖3 MTT檢測(cè)miR-142-3p對(duì)HEC-1A細(xì)胞增殖的影響與Control組和miR-NC組比較（＊P＜0.05）

圖6 Western blot檢測(cè)miR-142-3p對(duì)HEC-1A細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平的影響與Control組和miR-NC組比較（＊P＜0.05）

2.4 miR-142-3p過(guò)表達(dá)抑制HEC-1A細(xì)胞的遷移和侵襲Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與Control組和miR-NC組比較，miR-142-3p組HEC-1A細(xì)胞的遷移率和侵襲率均顯著降低 （P＜0.05）（圖4和5），表明miR-142-3p過(guò)表達(dá)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A的遷移和侵襲。

2.5 miR-142-3p過(guò)表達(dá)抑制HEC-1A細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-142-3p轉(zhuǎn)染后 HEC-1A細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯低于Control組和 miR-NC 組（P＜0.05）（圖 6），進(jìn)一步證實(shí) miR-142-3p過(guò)表達(dá)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A的遷移和侵襲能力。

圖6見(jiàn)封三。

3 討論

研究表明，miR-142-3p能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)功能在癌癥中發(fā)揮重要作用。朱翔宇等［12］發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在結(jié)直腸癌組織及癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯低于正常組織和細(xì)胞，且發(fā)現(xiàn)miR-142-3p高表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。國(guó)外學(xué)者Behzad Mansoori等［13］證實(shí) miR-142-3p 作為一種抑癌miRNA通過(guò)靶向Bach-1抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。此外，高建連等［14］研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在卵巢癌組織及癌細(xì)胞中低表達(dá)。該研究同時(shí)也表明miR-142-3p能夠通過(guò)靶向調(diào)控sirtuin 1抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)［11］，但其對(duì)子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為的影響尚無(wú)報(bào)道。

該研究發(fā)現(xiàn)與正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞相比，miR-142-3p在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中低表達(dá)，與Muralidharan Jayaraman 等［11］研究一致，揭示 miR-142-3p可能是診斷治療子宮內(nèi)膜癌的一個(gè)重要靶點(diǎn)。MTT和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-142-3p過(guò)表達(dá)顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A的增殖，遷移和侵襲。惡性腫瘤的重要特征是生長(zhǎng)不受限制，這不僅是由腫瘤細(xì)胞增殖和分化失控導(dǎo)致的，也與腫瘤細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)活化的MMP-2和MMP-9可以參與細(xì)胞外基質(zhì)元素的降解，減少細(xì)胞黏附，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處遷移［15］。發(fā)現(xiàn)miR-142-3p過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平，進(jìn)一步證實(shí)miR-142-3p能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

圖4 Transwell檢測(cè)miR-142-3p對(duì)HEC-1A細(xì)胞遷移的影響與Control組和miR-NC組比較（＊P＜0.05）

圖5 Transwell檢測(cè)miR-142-3p對(duì)HEC-1A細(xì)胞侵襲的影響與Control組和miR-NC組比較（＊P＜0.05）

綜上所述，miR-142-3p在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中低表達(dá)，通過(guò)提高miR-142-3p的表達(dá)可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。結(jié)果提示miR-142-3p參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展，有望成為子宮內(nèi)膜癌治療的新靶點(diǎn)。