王紅磊 韋紅巧 李祝森 秦英 馮勛偉 陳栩栩 陳攀紅 周靜

廣西醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，2臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)（南寧530007）

急性腦出血（acute cerebral hemorrhage，ACH）是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，為當(dāng)今臨床上常見的腦血管疾病之一［1］。研究［2］顯示，ACH 發(fā)病1 個(gè)月內(nèi)的病死率在我國(guó)高達(dá)40%，而且多伴隨有嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損癥狀，預(yù)后效果較差，目前對(duì)其尚缺乏有效的預(yù)防治療手段［3］。綠茶多酚（green tea polyphenol，GTP）因具有良好的抗氧化、抗凋亡、減輕機(jī)體自由基損傷、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)、預(yù)防心血管疾病等多種功能，在阿爾茲海默病、癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都顯示出保護(hù)作用［4-6］。但關(guān)于綠茶多酚應(yīng)用于急性腦出血方面的相關(guān)研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)通過建立急性腦出血大鼠模型，并給予綠茶多酚進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺失、腦組織抗氧化能力及神經(jīng)元損傷的影響，旨在為急性腦出血性疾病的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器清潔級(jí)成年SD雄性大鼠40 只，體質(zhì)量為240～270 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（桂）2003-0003］。經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)，飲食、飲水正常、無(wú)不良反應(yīng)者，納入實(shí)驗(yàn)；Ⅳ型膠原酶（購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司）；綠茶多酚（購(gòu)自安徽蕪湖天遠(yuǎn)生物科技有限公司，純度≥98%）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（購(gòu)自南京建成生物工程研究所）；TUNEL試劑盒（購(gòu)自上海碧云天公司）；大鼠腦立體定位儀（購(gòu)自瑞沃德公司）。

1.2 動(dòng)物分組及急性腦出血模型制備取適應(yīng)性喂養(yǎng)后的SD 雄性大鼠40 只，隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型對(duì)照組和綠茶多酚組，每組又分為3 d和7 d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)組，假手術(shù)組12 只，其他各組14 只。采用膠原酶加肝素腦內(nèi)定點(diǎn)注射建立大鼠急性腦出血模型：大鼠稱重后，10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于鼠腦立體定位儀上，常規(guī)備皮消毒，沿顱頂正中線切開皮膚，暴露顱骨標(biāo)志，參照《大鼠腦立體定位圖譜》［7］進(jìn)行左側(cè)內(nèi)囊定位：前囟后1.8 mm，中線左旁開3.2 mm，深5.4 mm。用牙科鉆鉆開顱骨，微量進(jìn)樣器抽取含肝素的膠原酶溶液（Ⅳ型膠原酶0.25 U/μL，肝素2.5 U/μL）0.65 μL 校準(zhǔn)上述進(jìn)針點(diǎn)后垂直進(jìn)針5.4 mm，緩慢注入，1 min 內(nèi)注完，留針5 min，緩慢退針，縫合頭皮。假手術(shù)組不注射藥物，其余手術(shù)過程相同。術(shù)后死亡的大鼠被剔除，并補(bǔ)足相應(yīng)的大鼠數(shù)目。

1.3 藥物治療急性腦出血模型制備成功后，綠茶多酚組以60 mg/（kg·d）腹腔注射綠茶多酚，模型對(duì)照組和假手術(shù)組腹腔注射等量生理鹽水，1 次/d，連續(xù)給藥3 d 或7 d，于末次給藥2 h 后進(jìn)行神經(jīng)功能和行為學(xué)評(píng)分，并斷頭取腦組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分采用改良Garcia 法［8］進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分，測(cè)試指標(biāo)包括：（1）自發(fā)性活動(dòng)（0 分：大鼠完全不動(dòng)；1 分：大鼠幾乎不動(dòng)；2 分：大鼠刺激后活動(dòng)；3 分：大鼠活動(dòng)頻繁，至少接觸籠子三面）；（2）四肢運(yùn)動(dòng)對(duì)稱性試驗(yàn)（0 分：大鼠右前肢完全癱瘓；1 分：大鼠右前肢輕微移動(dòng)；2 分：大鼠右前肢小幅度運(yùn)動(dòng)；3 分：大鼠四肢對(duì)稱性伸展）；（3）前爪伸展試驗(yàn)（0 分：大鼠右前肢無(wú)移動(dòng)；1 分：大鼠右前肢輕微移動(dòng)；2 分：大鼠右側(cè)肢體伸展度小于左側(cè)；3 分：大鼠雙前肢伸展）；（4）攀爬試驗(yàn)（1 分：大鼠無(wú)法攀爬；2 分：大鼠右側(cè)肢體受損；3 分：大鼠攀爬輕松、抓壁用力）；（5）本體感覺試驗(yàn)（1 分：大鼠右側(cè)肢體無(wú)反應(yīng)；2 分：大鼠右側(cè)肢體反應(yīng)緩慢；3 分：大鼠兩側(cè)肢體反應(yīng)對(duì)稱）；（6）對(duì)觸摸觸須的反應(yīng)（1 分：大鼠右側(cè)肢體無(wú)反應(yīng)；2 分：大鼠右側(cè)肢體反應(yīng)緩慢；3 分：大鼠兩側(cè)肢體反應(yīng)對(duì)稱）。神經(jīng)功能行為學(xué)的得分為6 項(xiàng)指標(biāo)分?jǐn)?shù)的總和，分?jǐn)?shù)越低，表示神經(jīng)功能障礙越重。

1.5 腦組織MDA 的含量及SOD、GSH-Px 酶活性測(cè)定于神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分后，麻醉大鼠，快速斷頭取全腦，冰生理鹽水漂洗干凈，分離左腦皮層，濾紙吸干后準(zhǔn)確稱重，按重量體積比加入9 倍的冰生理鹽水制成10 %的勻漿，4 000 r/ min 離心10 min，取上清液保存于-20℃冰箱待測(cè)。硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定MDA 含量；黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD 活力；5′，5-雙硫代對(duì)硝基苯甲酸（DTNB）直接法測(cè)定GSH-Px 活力，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 HE 染色處死各組大鼠，留取皮質(zhì)、海馬，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切為4 μm厚切片，經(jīng)二甲苯脫蠟及不同濃度乙醇水化后，行HE染色，40倍光鏡下觀察皮質(zhì)、海馬部位病理學(xué)改變。

1.7 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡處死各組大鼠，留取皮質(zhì)、海馬，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切為4 μm 厚切片，經(jīng)二甲苯脫蠟及不同濃度乙醇水化后，用蛋白酶K 于20～37 ℃處理10～30 min。PBS 漂洗3 次后用3%的H2O2于室溫處理20 min，隨后PBS 清洗3 次。然后按TUNEL 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行生物素標(biāo)記，經(jīng)DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、返藍(lán)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野（×400）觀察計(jì)數(shù)，以細(xì)胞出現(xiàn)棕色染色為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，取陽(yáng)性細(xì)胞比率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作圖采用GraphPad Prism8 軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異性分析采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組、綠茶多酚組大鼠的神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分均降低（P＜0.001）；給藥7 d 后，綠茶多酚組大鼠的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分較模型對(duì)照組提高（P＜0.05），見表1。

2.2 綠茶多酚對(duì)大鼠急性腦出血后腦組織MDA含量和SOD、GSH-Px 活性變化的影響與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組、綠茶多酚組的大鼠腦組織中MDA 含量均上升（P＜0.05），而SOD、GSH-Px 活性則下降（P＜0.05）；給藥7 d 后，與模型對(duì)照組比較，綠茶多酚組大鼠腦組織中MDA 的含量下降（P＜0.05）、SOD 和GSH-Px 的活性上升（P＜0.05），見表2、圖1。

表1 綠茶多酚對(duì)大鼠急性腦出血后神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分的影響Tab.1 Effects of green tea polyphenols on neurobehavioral scores after acute intracerebral hemorrhage in rats ±s，分

表1 綠茶多酚對(duì)大鼠急性腦出血后神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分的影響Tab.1 Effects of green tea polyphenols on neurobehavioral scores after acute intracerebral hemorrhage in rats ±s，分

注：與假手術(shù)組比較，★P ＜0.001；與模型對(duì)照組比較，△P ＜0.05

組別假手術(shù)組模型對(duì)照組綠茶多酚組動(dòng)物數(shù)12 14 14 3 d 17.67±0.52 11.29±2.43★13.43±1.81★7 d 17.83±0.41 14.43±0.79★15.57±0.98★△

表2 綠茶多酚對(duì)大鼠急性腦出血后腦組織MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性變化的影響Tab.2 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage ±s

表2 綠茶多酚對(duì)大鼠急性腦出血后腦組織MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性變化的影響Tab.2 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage ±s

注：與假手術(shù)組比較，★P ＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P ＜0.05；與模型對(duì)照組比較，※P ＜0.05

組別假手術(shù)組模型對(duì)照組綠茶多酚組MDA 含量（nmol/mgprot）3 d 0.66±0.13 1.03±0.19★0.91±0.21△7 d 0.62±0.19 1.24±0.30★0.89±0.21△※SOD 酶活性（U/mgprot）3 d 1.45±0.19 0.94±0.22★1.10±0.27△7 d 1.46±0.14 1.07±0.14★1.26±0.17△※GSH-Px 酶活性（U/mgprot）3 d 35.34±2.34 30.49±4.55△31.01±3.76△7 d 37.22±2.88 30.82±2.93★33.94±1.53△※

圖1 綠茶多酚對(duì)大鼠急性腦出血后腦組織MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性變化的影響Fig.1 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage

2.3 綠茶多酚對(duì)大鼠急性腦出血后腦組織病變的影響假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)、海馬組織形態(tài)正常，細(xì)胞周圍間隙正常，細(xì)胞核圓潤(rùn)，核染色質(zhì)均勻清楚；與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠皮質(zhì)、海馬組織形態(tài)明顯異常，組織間隙腫脹，細(xì)胞核固縮、濃染甚至破裂，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死、消失；給藥7 d后，與模型對(duì)照組比較，綠茶多酚組大鼠皮質(zhì)、海馬組織形態(tài)改善，細(xì)胞周圍間隙、細(xì)胞核固縮程度均減小，神經(jīng)細(xì)胞皺縮程度改善，壞死細(xì)胞減少，見圖2。

2.4 綠茶多酚對(duì)大鼠急性腦出血后腦組織細(xì)胞凋亡的影響光鏡下可見凋亡（陽(yáng)性）細(xì)胞為棕色，陰性細(xì)胞為藍(lán)紫色。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組大鼠皮質(zhì)、海馬部位細(xì)胞排列松散，神經(jīng)元凋亡均顯著增加（P＜0.001）；給藥7 d 后，與模型對(duì)照組比較，綠茶多酚組大鼠皮質(zhì)、海馬部位細(xì)胞排列重歸緊密，且神經(jīng)元凋亡均顯著下降（P＜0.001），見圖3。

圖2 大鼠皮質(zhì)、海馬部位病理結(jié)果比較（HE 染色，×400，n=6）Fig.2 Comparison of pathological results of cortex and hippocampus in rats（HE staining，×400，n=6）

圖3 TUNEL 法檢測(cè)大鼠皮質(zhì)、海馬部位神經(jīng)細(xì)胞凋亡（TUNEL 染色，×400，n=6）Fig.3 Detection of neuronal apoptosis in cortex and hippocampus of rats by TUNEL method(TUNEL staining,× 400,n=6)

3 討論

急性腦出血是我國(guó)臨床上常見的一種疾病，具有較高的致殘率和病死率，同時(shí)也因其有發(fā)病急、病情復(fù)雜危險(xiǎn)、患者預(yù)后效果不佳等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為臨床上的一大難題［9］。氧化應(yīng)激（oxidative stress）是指當(dāng)生物體內(nèi)氧化物與抗氧化物的動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí)，所表現(xiàn)出的潛在損傷狀態(tài)，其參與急性腦出血后的腦組織損傷病理過程，并在神經(jīng)元損傷過程中具有重要作用［10］。研究證實(shí)［11～13］，在急性腦出血后的氧化應(yīng)激過程中，機(jī)體可生成大量的氧自由基和MDA，進(jìn)而對(duì)腦組織產(chǎn)生毒性作用［14］。而過量氧自由基的釋放又可以誘導(dǎo)細(xì)胞中相關(guān)因子的活化，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［15］，而MDA 可加快機(jī)體內(nèi)胺類的氧化代謝，抑制單胺類物質(zhì)的合成，嚴(yán)重?fù)p傷神經(jīng)功能，亦可引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致明顯的行為學(xué)障礙［16］。同時(shí)，機(jī)體中已存在的能清除或抑制氧自由基的抗氧化物質(zhì)如SOD、GSH-Px 的含量也會(huì)在氧化應(yīng)激過程中發(fā)生大量消耗，使得機(jī)體抗氧化能力減弱，利于合成MDA，加劇腦損傷程度［17-19］。本實(shí)驗(yàn)中，通過建立急性腦出血大鼠模型，觀察到模型對(duì)照組大鼠腦組織中MDA 的含量上升，而SOD、GSH-Px活性下降，表明大鼠急性腦出血后腦組織中存在有氧化應(yīng)激效應(yīng)以及抗氧化能力的減弱，這與ZHANG 等［20］、ALADAG 等［21］研究結(jié)果一致，同時(shí)較之假手術(shù)組，模型對(duì)照組大鼠皮質(zhì)、海馬部位病理?yè)p傷明顯，神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加，也提示腦組織中抗氧化能力的減弱，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元過度凋亡現(xiàn)象。

綠茶多酚是綠茶中兒茶素類、黃酮類、芬酸類等一系列化合物的總稱，其藥理活性多樣，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含有多酚羥基，易被氧化而提供出H+質(zhì)子，故而具有極強(qiáng)的抗氧化能力［22］。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［23］，在肝、腎及腦損傷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激效應(yīng)中，綠茶多酚均能夠有效增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕氧化損傷程度，并可以阻斷細(xì)胞凋亡通路，抑制細(xì)胞凋亡過度，進(jìn)而對(duì)受損部位起到一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)表明，在給予綠茶多酚治療7 d 后，與模型對(duì)照組的大鼠比較，綠茶多酚組大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分的得分顯著升高，腦組織中SOD 和GSH-Px 活性增加、MDA 水平下降，提示綠茶多酚可以有效改善因急性腦出血導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷，并可提高腦組織的抗氧化應(yīng)激能力，同時(shí)HE與TUNEL 染色也顯示綠茶多酚可改善急性腦出血大鼠皮質(zhì)、海馬部位病理?yè)p傷，顯著降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這與DING 等［24］研究結(jié)果相似。

綜上所述，筆者認(rèn)為綠茶多酚對(duì)急性腦出血后腦損傷的保護(hù)作用與其能顯著改善急性腦出血后機(jī)體的抗氧化能力、減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，這可為綠茶多酚在急性腦出血治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，綠茶多酚對(duì)急性腦出血后腦損傷中的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步探討，這也為急性腦出血性疾病的臨床防治提供新的方法和思路。