袁仕國 顏麗滿 武凱 徐明奎 李義凱 鄒宇聰

1南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東省骨科研究院（廣州510630）；2海南省中醫(yī)院骨傷科（?？?70203）；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510006）

肌筋膜疼痛綜合征（myofascial pain syndrome，MPS）在疼痛中心占比可高達(dá)95%［1］，但也是臨床最常被忽視的疾病之一［2］。MPS 的關(guān)鍵特征是肌筋膜激痛點(diǎn)（myofascial trigger points，MTrPs），按壓可產(chǎn)生局部顫搐反應(yīng)、牽涉痛和自主神經(jīng)癥狀［3］。部分臨床癥狀，如局部膚溫高、出汗異常、顫搐反應(yīng)等，指向與自主神經(jīng)過度活躍有關(guān)［4］。研究［5］顯示MTrPs 可能受交感神經(jīng)影響，MTrPs 內(nèi)的交感-感覺相互作用可能會(huì)導(dǎo)致局部疼痛和牽涉痛以及出現(xiàn)交感神經(jīng)癥狀，因此臨床治療有必要重新評估針對交感神經(jīng)的治療。心肌損傷后會(huì)導(dǎo)致心交感神經(jīng)芽生重構(gòu)并高支配［6-7］，骨骼肌和心肌同屬于橫紋肌，骨骼肌損傷后是否也會(huì)發(fā)生交感神經(jīng)重構(gòu)和高支配，目前還沒有定論。研究［8-10］發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子對機(jī)體損傷及修復(fù)起著復(fù)雜的作用。研究［8-10］也發(fā)現(xiàn)MTrPs 局部存在炎癥因子的高表達(dá)。因此，MTrPs 局部交感神經(jīng)存在怎樣的變化，靶向交感神經(jīng)的治療是否能促進(jìn)MTrPs 修復(fù)，對骨骼肌損傷修復(fù)的關(guān)鍵干細(xì)胞-肌衛(wèi)星細(xì)胞（muscle satellite cells，MuSC）及炎癥因子等有何影響都成為本研究關(guān)注點(diǎn)。本研究擬在大鼠上探索MTrPs 造模后交感神經(jīng)的支配情況，并予以化學(xué)性交感神經(jīng)切除（chemical sympathectomy，CS），觀測相關(guān)的炎癥因子變化，評估肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、成肌分化和骨骼肌修復(fù)的情況，探索和拓展MPS的病理機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)可能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8 周的健康雄性SD 大鼠18 只，體質(zhì)量為220～250 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）20160041。常規(guī)飼養(yǎng)，動(dòng)物房維持（65 ± 5）%的濕度和（25 ± 3）℃的溫度，自由飲水、飲食。所有實(shí)驗(yàn)均在南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)下進(jìn)行，符合動(dòng)物管理與使用倫理準(zhǔn)則。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑根據(jù)文獻(xiàn)［12-13］自制木質(zhì)打擊器1 臺(tái)（打擊面直徑1 cm，總質(zhì)量為1 200 g，打擊高度為20 cm，動(dòng)能為2.352 J）。動(dòng)物試驗(yàn)跑臺(tái)（上海欣軟信息科技有限公司，XR-PT-10A），全波長多功能讀數(shù)酶標(biāo)儀（美國Thermo 賽默飛，Varioskan LUX），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Thermo 賽默飛，ABI Stpone plus），光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS，BX-53）。6-羥基多巴胺氫溴酸鹽（6-hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA）（中國阿拉丁，H4381），Rat TNF-α ELISA-Kit（中國Multi Sciences，EK382/3-48），Rat Noradrenaline-（NE）ELISA-Kit（中國Cloud-Clone Corp，CEA907Ge），Rat Interleukin 6，IL-6 ELISA KIT（中國CSB，CSBE04640r），Anti-TH Rabbit pAb抗體（中國ZEN BIO，511027），PAX7 抗體（美國Affinity，AF7584），RTPCR 引物由上海生工提供。

1.3 大鼠分組及干預(yù)

1.3.1 大鼠分組將18 只大鼠按照隨機(jī)表法分配到3 組中，每組6 只：A 組為空白對照組，B 組為MTrPs 造模組，C 組為MTrPs 造模+CS 組。

1.3.2 MTrPs 造模B、C 組大鼠采用打擊結(jié)合離心運(yùn)動(dòng)的造模方法進(jìn)行MTrPs 造模［12-13］。第1 天進(jìn)行右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌打擊損傷，第2 天進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)。每周進(jìn)行打擊和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)1 次，連續(xù)4 周，然后再恢復(fù)4 周。

1.3.3 化學(xué)性交感神經(jīng)切除C 組大鼠在第8 周MTrPs 造模完成后開始，每3 天腹腔注射6-ODHA 1 次，用量為100 mg/kg，連續(xù)腹腔注射2 次以完全阻斷交感神經(jīng)［14］。A組和B組注射等量生理鹽水。

1.3.4 取材化學(xué)性交感神經(jīng)切除10 d，過量麻醉處死大鼠取材。按文獻(xiàn)方法取材，具體方法：暴露右股四頭肌，輕輕按壓探尋股內(nèi)側(cè)肌打擊部位及周圍的肌緊張帶，可觸及明顯的緊張帶和/或膨大的結(jié)節(jié)，并予以針灸針刺入此處，引出顫搐反應(yīng)者即為MTrPs。A 組取右股內(nèi)側(cè)肌相應(yīng)部位。標(biāo)本取材約1 cm3。

1.4 組織切片處理

1.4.1 固定與切片標(biāo)本取材后于40 g/L 多聚甲醛4 ℃固定24 h，30%蔗糖脫水約24 h 至標(biāo)本沉底，OCT 包埋，10 μm 厚冰凍切片。

1.4.2 蘇木素-伊紅（Hamematoxylin-eosin，HE）染色常規(guī)HE 染色：蘇木素染色2.5 min，伊紅染色2 min。光鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5 個(gè)切片，每個(gè)切片采集5 個(gè)200 倍視野圖片，使用Image J 軟件分析肌細(xì)胞所占面積，計(jì)數(shù)攣縮結(jié)節(jié)數(shù)量，最終取其均數(shù)，下同。

1.4.3 免疫熒光切片于山羊血清常溫封閉1 h，Pax7 和TH 一抗?jié)舛葹?∶150，4 ℃孵育16 h，避光加入濃度為1∶400 的二抗，4 ℃孵育2 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚封片，熒光顯微鏡拍照。

1.5 ELISA 測定NE 和炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)在4 ℃下MTrPs組織勻漿加入去離子水（1∶9），勻漿液10 000 r/min 離心30 min，上清液12 000 r/min 離心60 min。各樣品嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書操作，并采用Curve Expert 2.20 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，計(jì)算樣本各指標(biāo)濃度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有樣品均一式兩份進(jìn)行檢測。

1.6 RT-PCR 測定MyoG、MyoD 基因表達(dá)按100 mg組織加入1 mL TRIzol，勻漿，加入1/5體積氯仿，其余按常規(guī)步驟提取RNA。依次加入抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取0.2 mL 無酶管，分別加入如下反應(yīng)體系：12.5 μL 2 × qPCR Mix，2.0 μL 7.5 μmol/L 基因引物，2.5 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和8.0 μL ddH2O，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3 管復(fù)孔，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增（表1）。結(jié)果通過2-ΔΔCt方法計(jì)算的MyoD和MyoG 基因表達(dá)的倍數(shù)變化。

表1 MyoG 和MyoD 引物序列Tab.1 MyoG and MyoD primer sequences

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所采集數(shù)據(jù)用（）表示。Levene 法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊時(shí)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK-q法比較；方差不齊時(shí)用Welch 法進(jìn)行近似方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett′s T3 法比較；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料大鼠造模后無骨折、皮膚破潰、感染等。C 組在注射第2 次后死亡1 只。

2.2 各組肌細(xì)胞病理形態(tài)的變化A 組肌細(xì)胞呈規(guī)則排列的多邊形或長條形，間隙均勻，無斷裂，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤（圖1A、B）。B 組的肌細(xì)胞形成攣縮結(jié)節(jié)、間隙明顯增寬，同時(shí)肌細(xì)胞萎縮、斷裂，可見炎癥細(xì)胞浸潤；橫截面上呈現(xiàn)出類圓形和不規(guī)則形，縱截面上呈扭曲長條形（圖1C、D）。C組肌細(xì)胞明顯較B 組再生；可見少量攣縮結(jié)節(jié)，較B 組減少；肌細(xì)胞橫截面上呈大小不等的多邊形或類圓形，炎癥細(xì)胞浸潤基本消失（圖1E、F）。

圖1 各組骨骼肌HE 染色（箭頭所示為攣縮結(jié)節(jié)）Fig.1 HE staining of skeletal muscle in each group（arrows show contracture knots）

2.3 各組肌細(xì)胞面積比例和攣縮結(jié)節(jié)數(shù)量3組中橫截面和縱截面的肌細(xì)胞面積比例均為A ＞C ＞B，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.31、34.59，P＜0.01，圖2A、B，表2）。說明交感神經(jīng)阻斷可促進(jìn)肌細(xì)胞面積恢復(fù)。攣縮結(jié)節(jié)數(shù)量均為B ＞C ＞A，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 32.83、326.15，P＜0.01，圖2C、D，表2）。結(jié)果說明CS 可減少攣縮結(jié)節(jié)。

2.4 IL-6、TNF-α和NE 的表達(dá)A、B、C 3 組中MTrPs 局部的IL-6 分別為（6.87 ± 2.73）、（87.99 ±20.09）、（47.66 ± 15.91）pg/g，TNF-α分別為（32.39±31.72）、（665.82±124.62）、（230.29 ± 96.15）pg/g，均為B ＞C ＞A，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.07、73.33，P＜0.01，圖3A、B）。而NE 分別為（293.55±60.37）pg/g、（722.67 ± 185.61）pg/g、（60.70 ± 10.87）ng/g，B ＞A ＞C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 46.15，P＜0.01，圖3C）。說明CS 處理后NE 明顯降低，且可降低IL-6 和TNF-α炎癥因子的表達(dá)。

2.5 MyoD 和MyoG 基因的表達(dá)A、B、C 3 組中MTrPs 局 部MyoD 分 別 為（0.84 ± 0.14）、（1.95 ±0.36）、（1.20 ±0.16），B ＞C ＞A，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 31.95，P＜0.01，圖4A）。MyoG 分別為（0.42±0.19）、（0.53 ± 0.22）、（0.93 ± 0.17），3 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 10.33，P＜0.01，圖4B），C 組最高，組間比較顯示雖然B 組數(shù)值較A 組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.77）。即造模后成肌分化因子MyoD 基因激活表達(dá)，但成肌分化的終末因子MyoG 在B 組上升不明顯，而C 組較B 組相對降低MyoD 和提升MyoG 基因的表達(dá)，且仍較正常對照的A 組高。

表2 各組肌細(xì)胞面積比例和攣縮結(jié)節(jié)數(shù)量Tab.2 Proportion of muscle cell area and number of contracture knots in each group ±s

表2 各組肌細(xì)胞面積比例和攣縮結(jié)節(jié)數(shù)量Tab.2 Proportion of muscle cell area and number of contracture knots in each group ±s

注：組間兩兩比較，**P ＜0.05，*P ＜0.01，#P ＞0.05

組別A 組B 組C 組F 值P 值例數(shù)6 6 5肌細(xì)胞橫切面積比例（%）72.68±11.59#31.21±13.01*53.93±5.14#22.31＜0.01肌細(xì)胞縱切面積比例（%）72.78±10.97#29.05±9.21*52.73±5.85#34.59＜0.01橫截面攣縮結(jié)節(jié)數(shù)量4.17±1.47*67.00±18.91*38.60±13.54*32.83＜0.01縱截面攣縮結(jié)節(jié)數(shù)量7.06±2.42*98.85±30.11*59.59±19.92*326.15＜0.01

圖2 各組肌細(xì)胞面積比例和攣縮結(jié)節(jié)數(shù)量Fig.2 Proportion of muscle cell area and number of contracture knots in each group

圖3 各組IL-6、TNF-α和NE 的表達(dá)Fig.3 Expression of IL-6，TNF-α and NE in each group

2.6 TH的免疫熒光檢測A、B、C 3組TH的熒光強(qiáng)度值橫截面上分別為（2.51 ± 0.39）、（3.74 ± 0.42）、（1.04±0.19）μm2/（mm2·103），縱截面上分別為（1.70±0.41）、（4.66±0.72）、（1.03±0.24）μm2/（mm2·103），B ＞A ＞C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 75.97、81.73，P＜0.01）。即MTrPs 造模后TH 高表達(dá)，交感神經(jīng)存在重構(gòu)和高支配現(xiàn)象。CS 可明顯下調(diào)TH 的表達(dá)，即CS 可明顯抑制交感神經(jīng)活性。見圖5、圖6A、B。

圖4 各組MyoD 和MyoG 基因的表達(dá)Fig.4 MyoD and MyoG gene expression in each group

2.7 Pax7 的免疫熒光檢測A、B、C 3 組Pax7 的熒光強(qiáng)度值橫截面上分別為（4.29 ± 1.29）、（1.09± 0.26）、（2.80 ± 0.48）μm2/（mm2·103），縱截面上分別為（4.53 ±1.25）、（1.03±0.41）、（2.58±0.60）μm2/（mm2·103），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A ＞C ＞B（F=30.73、25.94，P＜0.01，圖6C、D 和7）。即MTrPs 造模后Pax7 低表達(dá)，MuSC 大量激活并分化，并有耗竭趨勢。MTrPs 造模后，給予CS 可明顯上調(diào)Pax7 的表達(dá)，即CS 可抑制MuSC 的過度激活分化，對維持MuSC 的數(shù)量具有重要的意義。

圖5 TH 的免疫熒光的表達(dá)（200×）Fig.5 Expression of TH immunofluorescence（200×）

3 討論

MPS 是由MTrPs 引起的感覺、運(yùn)動(dòng)和自主神經(jīng)癥狀的綜合征，常由急慢性肌肉損傷導(dǎo)致的，適度的炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞浸潤可促進(jìn)肌肉的修復(fù)。炎癥細(xì)胞的過度浸潤則導(dǎo)致纖維化［15］，肌肉組織失去原有的功能，對功能恢復(fù)是不利的。炎癥因子可激活并促M(fèi)uSC 分化，但過度的炎癥刺激導(dǎo)致其成肌分化受抑制，并可能導(dǎo)致MuSC 的耗竭［16］。需要調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞和炎癥因子合適的表達(dá)以促進(jìn)MTrPs 成肌修復(fù)、快速修復(fù)，達(dá)到良好的功能和形態(tài)的修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MTrPs 造模后，MTrPs 骨骼肌萎縮，并且造模組同時(shí)肌細(xì)胞還形成攣縮結(jié)節(jié)，且數(shù)量眾多。這些組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)與先前的研究一致［17］。MTrPs 造模后IL-6 和TNF-α均顯著升高，炎癥細(xì)胞明顯浸潤［9］。IL-6 和TNF-α是眾多炎癥因子的代表，IL-6 既可促進(jìn)又可抑制炎癥［18］。而炎癥因子可激活MuSC，MuSC 激活后其干性的標(biāo)志之一Pax7 消失［19］。MuSC 激活后進(jìn)行增殖，重新歸于靜止并恢復(fù)MuSC 的數(shù)量并保持其干性，或分化為成肌或成纖維細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MTrPs 造模后MyoD 明顯高表達(dá)，而Pax7 顯著降低，即MuSC大量激活，但成肌生長因子MyoG 則升高不明顯，提示MuSC 激活后可能因局部微環(huán)境的變化向非成肌方向分化。同時(shí)Pax7 顯著降低，提示MTrPs中可能微環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致MuSC 的數(shù)量減少甚至耗竭，從而導(dǎo)致肌肉持續(xù)萎縮、無法成肌修復(fù)。

圖6 各組TH 熒光強(qiáng)度值Fig.6 Fluorescence intensity of TH in each group

圖7 各組骨骼肌MTrPs 局部Pax7 表達(dá)（400×）Fig.7 Local MTrPs Pax7 expression of skeletal muscle in each group（400×）

MPS 患者局部顫搐反應(yīng)、出汗異常、膚溫異常以及交感神經(jīng)皮膚反應(yīng)等癥狀指向MTrPs 局部可能存在交感神經(jīng)重構(gòu)和異常支配［20］。目前普遍認(rèn)可的觀點(diǎn)認(rèn)為神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常是MTrPs 的中心環(huán)節(jié)［21］。文獻(xiàn)報(bào)道患者上部斜方肌的MTrPs 的NE 濃度較高，而較高濃度的神經(jīng)遞質(zhì)誘發(fā)形成MTrPs［22-23］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MTrPs 局部NE 濃度明顯較空白對照組高，而CS 處理后NE 的表達(dá)明顯降低，與此同時(shí)MTrPs 的肌細(xì)胞面積明顯增加，炎癥細(xì)胞浸潤基本消失，炎癥因子IL-6 和TNF-α均顯著降低。表明CS 可以促進(jìn)MTrPs 成肌修復(fù)。然而矛盾的是，CS 處理后MTrPs 局部的MyoD 和MyoG基因表達(dá)反而較單純造模組降低，但Pax7 反而較單純造模組高，表明抑制交感神經(jīng)的高支配有利于維持MuSC 的干性。這種抑制MuSC 的過度激活并維持其干性的作用機(jī)制，可能是CS 促進(jìn)成肌修復(fù)的重要原因。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物模型中成功構(gòu)建了MTrPs，證明了MTrPs 發(fā)生了交感神經(jīng)的重構(gòu)，導(dǎo)致其高支配，這可能對MTrPs 的病理認(rèn)識(shí)以及MPS 的診治有益。抑制交感神經(jīng)高支配，有利于維持MuSC 的干性，抑制MuSC 的過度激活，并促進(jìn)成肌的終末分化，從而促進(jìn)成肌修復(fù)。但是，本實(shí)驗(yàn)為初步的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，由于缺乏時(shí)間梯度的研究，缺乏詳盡的作用機(jī)制研究，仍需要全面系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)證明之。