王曉娜，許麗娜

芒果苷是芒果葉中的主要活性物質(zhì)，是一種天然多酚類化合物[1]。芒果苷在抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和鎮(zhèn)痛等方面均具有一定的活性[2-5]。帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其臨床癥狀包括運(yùn)動(dòng)遲緩、姿勢(shì)步態(tài)異常、肌強(qiáng)直和靜止性震顫等[6]。PD的主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的變性死亡。PD與遺傳、環(huán)境因素、感染、衰老、氧化應(yīng)激和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏等密切相關(guān)[7]。疾病狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力降低、受損，因?yàn)轸驶脑龆嗉白杂苫宄煌耆斐刹煌潭鹊难趸瘧?yīng)激損傷[8]。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞形態(tài)、生理和生化功能等方面與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物篩選和發(fā)病機(jī)制研究[9]。本實(shí)驗(yàn)采用過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立帕金森細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)芒果苷對(duì)PD的保護(hù)作用并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫。芒果苷購自成都普利斯生物科技有限公司；胎牛血清購自Gibco公司；MEM/F12高糖培養(yǎng)液購自江蘇凱基生物有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）購自武漢博士德生物工程有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙 二 醛（maleic dialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程公司；兔源雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatase，DUSP）6單克隆抗體購自成都正能生物公司；兔源ERK1/2、p-ERK1/2單克隆抗體、Keap1單克隆抗體、核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）、HO-1單克隆抗體和二抗（HRP-GOAT anti-Rabbit）購自武漢三鷹生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組SH-SY5Y細(xì)胞用含10%小牛血清的MEM/F12高糖培養(yǎng)液、37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（PBS平行處理）、模型組（含100μmol/L的H2O2培養(yǎng)基處理細(xì)胞4 h）、芒果苷高、中、低劑量組（先用含芒果苷100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L的培養(yǎng)基處理4 h后，加入200μmol/L的H2O2培養(yǎng)基處理細(xì)胞4 h）。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心10 min，將濃度為1×106個(gè)/mL（100μL）細(xì)胞接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞中分別加入不同濃度的芒果苷（6.25、12.5、25、50、100和200μmol/L）和H2O2（0、50、100、200和400μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。在實(shí)驗(yàn)終止前加入10μL MTT（5.0 mg/mL）孵育4 h，每孔加適量DMSO，震搖10 min，酶標(biāo)儀于490 nm測(cè)定處吸光度，計(jì)算細(xì)胞的活力。

1.2.3 LDH活性的測(cè)定收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別收集培養(yǎng)液的上清液，按LDH試劑盒說明書的要求測(cè)量各組細(xì)胞上清液中LDH活性。

1.2.4 MDA和SOD水平的測(cè)定收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別收集各組細(xì)胞，制備好細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心10 min，沉淀用PBS清洗2次，加入裂解液充分裂解，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。MDA和SOD檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD含量。

1.2.5 Western blot細(xì)胞以胰酶消化后加培養(yǎng)液終止消化，加入細(xì)胞裂解液低溫充分裂解，離心收集上清，以BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入loading buffer煮沸變性。取等量蛋白樣品加入10%SDS-PAGE膠，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉3 h，于一抗中4℃孵育過夜。次日充分洗膜后，二抗孵育2 h，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影，并對(duì)免疫印跡條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 芒果苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，200 nmol/L芒果苷預(yù)孵育4 h后，細(xì)胞活力降低（P＜0.05），其余各濃度芒果苷預(yù)孵育4 h后的SH-SY5Y細(xì)胞活力無顯著改變，見圖1。

2.2 H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞造模條件的篩選

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，在H2O2作用下，細(xì)胞活力下降呈現(xiàn)劑量依賴性，100、200和400μmol/L H2O2作用后細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01）。在后續(xù)的研究中選擇200μmol/L H2O2為造模條件，見圖2。

2.3 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，芒果苷高、中、低劑量組（用100 nmol/L、50 nmol/L、25 nmol/L芒果苷治療）細(xì)胞的存活率明顯升高（P＜0.05），見圖3。

2.4 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組LDH活性和MDA水平均顯著性升高（P＜0.01），SOD水平顯著降低（P＜0.01）；芒果苷高、中、低劑量組LDH活性和MDA水平均較模型組顯著性降低（P＜0.01），SOD水平顯著升高（P＜0.01），見表1。

2.5 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞DUSP6和ERK表達(dá)的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組中的DUSP6蛋白表達(dá)增加，p-ERK1/2蛋白表達(dá)減少；與模型組比較，芒果苷高、中、低劑量組DUSP6蛋白表達(dá)減少，p-ERK1/2蛋白表達(dá)增加，見圖4、表2。

2.6 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞Keap1/Nrf2通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組中的Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)減少，Keap1蛋白表達(dá)增多；與模型組比較，芒果苷高、中、低劑量組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)增多，Keap1蛋白表達(dá)減少，提示芒果苷能 逆 轉(zhuǎn)H2O2損 傷SH-SY5Y細(xì) 胞 中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)，見圖5，表3。

圖1 不同濃度芒果苷對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

圖2 不同濃度H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

圖3 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

表1 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞LDH、MDA和SOD的影響（±s）

表1 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞LDH、MDA和SOD的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

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3 討論

PD發(fā)病機(jī)制不明確，氧化應(yīng)激學(xué)說是目前的研究熱點(diǎn)之一。氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝物增加或細(xì)胞中氧化保護(hù)機(jī)制不足時(shí)，活性氧物質(zhì)清除水平降低，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)增多并引起細(xì)胞氧化損傷的病理過程[10]。神經(jīng)元代謝產(chǎn)生的多胺醌類物質(zhì)和H2O2及超氧基等細(xì)胞毒性物質(zhì)，在黑質(zhì)內(nèi)高濃度鐵離子的催化下能產(chǎn)生更劇毒性的羥基損傷細(xì)胞，導(dǎo)致了多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞更容易產(chǎn)生應(yīng)激狀態(tài)。氧化應(yīng)激在黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元的變性中發(fā)揮著重要的作用[11]。改善氧化應(yīng)激是保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的重要途徑。

芒果苷能抑制坐骨神經(jīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解坐骨神經(jīng)結(jié)扎引起的神經(jīng)病理性疼痛[12]；以芒果苷給予大鼠灌胃7 d后，腦組織炎癥和氧化應(yīng)激損傷程度降低[13]；這提示芒果苷可能是神經(jīng)損傷保護(hù)劑。

DUSP是一類磷酸酶，能對(duì)磷酸化的酪氨酸和絲/蘇氨酸去磷酸化，因此被稱為雙特異性磷酸酶[13]。DUSP參與多種病理過程和各種信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)及新陳代謝等[14]。DUSP6是一種MAPK磷酸酶，在MAPK通路中起負(fù)性調(diào)控作用。Ari等[15]發(fā)現(xiàn)睪丸酮代謝物可通過DUSP6依賴的機(jī)制抑制SH-SY5Y細(xì)胞中氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的ERK磷酸化和神經(jīng)毒性，表明DUSP6/ERK可降低氧化應(yīng)激條件下的神經(jīng)毒性損傷。Nrf2是抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，正常條件下，它與胞漿蛋白伴侶分子Keap1結(jié)合使活性處于抑制狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2會(huì)從Keap1解耦連并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)原件ARE上位點(diǎn)結(jié)合，通過上調(diào)眾多的細(xì)胞抗氧化基因來抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生[16]。DUSP6/ERK和Keap1/Nrf2是調(diào)控氧化應(yīng)激的關(guān)鍵通路[17]。MDA是脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)物，可以直接反映活性氧對(duì)脂質(zhì)過氧化程度，SOD則直接反映機(jī)體清除自由基能力的強(qiáng)弱[18]。

圖4 芒果苷對(duì)DUSP6、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

表2 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞DUSP6和p-ERK蛋白表達(dá)的影響(%)

圖5 芒果苷對(duì)Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

表3 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響（%,±s）

表3 芒果苷對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響（%,±s）

注：與空白對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

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本研究結(jié)果表明芒果苷能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH的釋放，降低細(xì)胞中MDA的含量，增加SOD活性；初步作用機(jī)制是芒果苷能抑制DUSP的表達(dá)和ERK的磷酸化程度，同時(shí)顯著下調(diào)Keap1的表達(dá)水平，上調(diào)Nrf2、HO-1的表達(dá)水平。這些結(jié)果提示芒果苷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷有抑制保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)DUSP/ERK和Keap1/Nrf2通路抑制氧化應(yīng)激。芒果苷對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病可能具有治療作用，但要得到確切結(jié)論尚需進(jìn)一步研究。