麻華膽 黃慶 鄭愛甜 劉賢彬 李政 王琳 曾娜 吳標(biāo)良

【摘要】 目的 觀察糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合過程中UNC-51樣激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）的變化，初步探討細(xì)胞自噬在糖尿病慢性創(chuàng)面愈合中的作用。 方法 SPF級Wistar雄性大鼠18只，隨機(jī)分為對照組、模型組，每組9只。模型組建立糖尿病模型，隨后兩組大鼠均行全層皮膚切除。分別于第1天、第11天、第18天觀察創(chuàng)面愈合情況并于上述各個時相點(diǎn)每組隨機(jī)取3只大鼠采集創(chuàng)面組織，HE染色觀察組織病理改變，Western blotting法檢測ULK1及其磷酸化水平，qRT-PCR分析ULK1基因的表達(dá)。結(jié)果 （1）創(chuàng)面愈合情況及組織病理改變：模型組創(chuàng)面愈合速度較對照組快，組織病理改善差于對照組。（2）第1天、第11天，模型組ULK1蛋白表達(dá)低于對照組，第18天，模型組ULK1蛋白表達(dá)高于對照組（P<0.05），p-ULK1在對照組、模型組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。（3）第1天、第11天，模型組ULK1 mRNA表達(dá)低于對照組，第18天，模型組ULK1 mRNA表達(dá)高于對照組（P<0.05）。結(jié)論 糖尿病慢性創(chuàng)面愈合過程中細(xì)胞自噬可能受到抑制，可能是糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合不良的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 ULK1;糖尿病;潰瘍創(chuàng)面;細(xì)胞自噬

中圖分類號：R587.2 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.07.002

【Abstract】 Objective To observe the changes of UNC-51-like kinase1（ULK1） in the process of wound healing in diabetic rats，and to preliminarily investigate the role of autophagy in chronic wound healing in diabetes mellitus.Methods 18 male Wistar rats of SPF grade were randomly divided into control group and model group with 9 rats in each group.The diabetic model was established in the model group，and then full-layer skin resection was performed in both groups.Wound healing was observed on day 1，day 11 and day 18，respectively，and 3 rats were randomly selected from each group to collect wound tissues at the above time points，HE staining was performed to observe histopathological changes，ULK1 and its phosphorylation levels were detected by Western blotting，and ULK1 gene expression was analyzed by qRT-PCR.Results （1） Wound healing and histopathological changes：the wound healing rate of the model group was slower than that of the control group，and the histopathological improvement was worse than that of the control group.（2） On day 1 and day 11，the expression of ULK1 protein in the model group was lower than that in the control group，and on day 18，the ULK1 protein expression in the model group was higher than that in the control group（P<0.05），and there was no statistically significant difference in the expression of p-ULK1 between the control group and the model group（P>0.05）.（3） On day 1 and day 11，ULK1 mRNA expression in the model group was lower than that in the control group，on day 18，ULK1 mRNA expression in the model group was higher than that in the control group（P<0.05）.Conclusion Autophagy may be inhibited during chronic wound healing in diabetes mellitus，which may be one of the mechanisms of poor wound healing in diabetic ulcer.

【Key words】 ULK1;diabetes;ulcer wound;autophagy

細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞生物中的蛋白質(zhì)降解方式，參與維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，在疾病的轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。ULK1為自噬的啟動因子，主要通過磷酸化修飾而改變自身活性，影響自噬進(jìn)程[1]。糖尿病潰瘍創(chuàng)面受代謝紊亂的影響，愈合效率低下，然而其潛在機(jī)制尚未完全明了，本實(shí)驗(yàn)通過觀察糖尿病狀態(tài)下自噬水平的變化，探討糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合不良的機(jī)制，以期為糖尿病潰瘍創(chuàng)面治療方法的開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar雄性大鼠18只，3月齡，體重230～260 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）：北京華越洋生物科技有限公司生產(chǎn);水合氯醛：成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);ULK1-Antibody、p-ULK1（phospho S758）-Antibody：Abcam公司生產(chǎn);山羊抗兔Ig、β-actin抗體：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);ULK1、β-actin引物：上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及糖尿病創(chuàng)面模型的建立 大鼠予適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照組、模型組，每組9只。對照組大鼠在背部行約2.5 cm×2.5 cm面積大小全層皮膚切除;模型組予高脂飲食4周，禁食16小時后腹腔注射STZ，1周后大鼠出現(xiàn)多飲、多尿、體重減少等糖尿病癥狀且空腹血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型建立成功。糖尿病大鼠造模成功后作全層皮膚切除，即完成糖尿病創(chuàng)面大鼠模型的建立[2]。

1.3.2 標(biāo)本采集與處理 各組于創(chuàng)面模型建立后第1天、第11天、第18天共3個時間點(diǎn)各隨機(jī)取3只大鼠，腹腔注射麻醉，采集造模區(qū)創(chuàng)面組織后將大鼠處死。將采集到的樣本之一用10%福爾馬林固定制作HE染色切片，其余樣本置于-80℃冰箱保存，待行qRT-PCR和Western blotting檢測。

1.3.3 HE染色觀察病理改變 創(chuàng)面組織固定48小時后依次脫水、透明、浸蠟包埋、切片、烤片、HE染色制片，光學(xué)顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤、肉芽組織生長及再上皮化情況。

1.3.4 Western blotting法檢測ULK1、p-ULK1的表達(dá)水平 液氮研磨待檢組織，加組織裂解液充分裂解，提取總蛋白，測定總蛋白質(zhì)濃度并計算蛋白質(zhì)上樣量。制作SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后4 ℃孵育一抗過夜，PBST洗膜3次，然后加入二抗，室溫下孵育60 min，PBST洗膜3次后顯影，使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

1.3.5 qRT-PCR分析ULK1 mRNA的表達(dá) 以未建立模型（空白組）的大鼠背部皮膚組織作為對照樣本，液氮研磨待檢組織，按照組織提取RNA的方法提取總RNA，測定總RNA的濃度及質(zhì)量。將質(zhì)量合格的總RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板，合成cDNA，然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果使用公式：F=2- ?Ct轉(zhuǎn)換。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩因素重復(fù)測量方差分析進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) ?果2.1 創(chuàng)面愈合情況及組織病理改變 第11天，兩組大鼠肉眼可見創(chuàng)面紅潤，大片肉芽組織，鏡下可見炎癥細(xì)胞浸潤，大量成纖維細(xì)胞及毛細(xì)血管形成，但對照組肉芽組織長勢優(yōu)于模型組，炎性浸潤輕于模型組。第18天，對照組大鼠創(chuàng)面基本愈合，僅留一點(diǎn)狀疤痕，鏡下可觀察到完整表皮及皮膚附屬器;模型組大鼠創(chuàng)面可見顆粒狀肉芽組織生長，鏡下仍可見到少許炎癥細(xì)胞浸潤及廣泛分布的毛細(xì)血管網(wǎng)，但均較第11天明顯減少（圖1～圖2）。

2.2 ULK1、p-ULK1蛋白檢測結(jié)果 兩因素重復(fù)測量方差分析顯示，組間因素和時間因素的交互作用對ULK1表達(dá)的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），即對照組和模型組中ULK1的表達(dá)均隨時間的變化而改變，對照組和模型組中ULK1的表達(dá)均升高后下降，第11天的表達(dá)量最高，第1天的表達(dá)量最低，第1天、第11天，模型組ULK1表達(dá)低于對照組，第18天，模型組ULK1表達(dá)高于對照組（P<0.05）。組間因素和時間因素對p-ULK1表達(dá)的影響不存在交互作用（P=0.056），p-ULK1在對照組、模型組間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.142），p-ULK1在創(chuàng)面愈合過程中各個時相點(diǎn)的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見圖3、表1～表2。

2.3 ULK1 mRNA檢測結(jié)果 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，對照組、模型組ULK1 mRNA隨時間的變化幅度不同（P<0.001），對照組ULK1 mRNA的表達(dá)升高后下降，第11天的表達(dá)量最高，第1天的表達(dá)量最低，而模型組ULK1 mRNA的表達(dá)逐漸升高后趨于平穩(wěn);第1天、第11天，模型組ULK1 mRNA表達(dá)低于對照組，第18天，模型組ULK1表達(dá)高于對照組（P<0.05）。見表3。

3 討 ?論 ?細(xì)胞自噬是真核生物進(jìn)化過程中高度保守的降解系統(tǒng)，在應(yīng)激過程中，通過高爾基復(fù)合體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的雙層膜結(jié)構(gòu)將胞內(nèi)異常蛋白和受損細(xì)胞器包裹，形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體并將其內(nèi)容物降解，部分降解產(chǎn)物可作為營養(yǎng)底物參與細(xì)胞的新陳代謝以獲得細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。ULK1的活性主要受哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的調(diào)節(jié)。能量充足的情況下，mTORC1將Ser758和Ser638位點(diǎn)磷酸化，抑制ULK1活性;饑餓狀態(tài)下，AMPK通過磷酸化ULK1、Ser317 和Ser777等多個位點(diǎn)激活ULK1[1]，此外，ULK1亦可發(fā)生自身磷酸化（Thr180位點(diǎn)）而導(dǎo)致自噬終止[3]。研究表明，自噬參與免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管再生和膠原合成而在創(chuàng)面組織修復(fù)中發(fā)揮積極的作用[4]。

本研究顯示：模型組創(chuàng)面愈合速度及病理改善均差于對照組，這與前期研究結(jié)果一致，糖尿病創(chuàng)面愈合延遲與糖尿病狀態(tài)下的胰島素抵抗（insulin resistance，IR）[5]、自主神經(jīng)功能紊亂[6]、糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的堆積[7]、免疫和血管功能障礙[8]等因素相關(guān)。在創(chuàng)面形成早期，模型組ULK1蛋白及ULK1 mRNA的表達(dá)量低于對照組，表明糖尿病狀態(tài)抑制細(xì)胞自噬，糖尿病狀態(tài)下的細(xì)胞功能受損及蛋白合成不足為主要影響因素。高糖環(huán)境下，線粒體和溶酶體功能受損，促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，并阻斷自噬流[9]。p38/MAPK作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白激酶，具有促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白 （autophagy-related ?protein，Atg）基因轉(zhuǎn)錄的功能，高糖暴露下，p38/MAPK途徑受抑制并伴隨自噬失活[10]，此外，相關(guān)研究表明，高血糖對自噬的損害與賴氨酸63泛素化蛋白（lysine63 ubiquitinated proteins，Lys63-Ub）的積累[11]及時鐘基因Bmal1的表達(dá)抑制[12]有關(guān)。在創(chuàng)面愈合過程中，對照組大鼠自噬水平呈先升高后降低的趨勢，推測為創(chuàng)面形成早期，在應(yīng)激及創(chuàng)面缺血缺氧的誘導(dǎo)下，mTORC1受抑制，ULK1去磷酸化，從而激發(fā)自噬活性，隨著新生血管形成，缺血缺氧改善，mTORC1抑制解除，ULK1磷酸化水平升高，引起自噬抑制。由于模型組在創(chuàng)面形成晚期尚未愈合，細(xì)胞仍處于能量缺乏狀態(tài)，因此其第18天的自噬水平無明顯降低，較對照組具有更強(qiáng)的自噬誘導(dǎo)作用，從而表現(xiàn)為模型組ULK1蛋白及ULK1 mRNA的表達(dá)量高于對照組。該結(jié)果也表明，創(chuàng)面愈合過程中，饑餓狀態(tài)對自噬的誘導(dǎo)作用遠(yuǎn)大于糖尿病狀態(tài)對自噬的抑制作用。關(guān)于p-ULK1在對照組、模型組中表達(dá)無顯著性差異的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為，ULK1的活化涉及其分子結(jié)構(gòu)中多個位點(diǎn)的磷酸化與去磷酸化，此外，泛素化[13]、乙?；痆14]等修飾亦被認(rèn)為參與其中，可見，ULK1的活化機(jī)制十分復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)中使用Ser758位點(diǎn)磷酸化的p-ULK1抗體，推測在糖尿病狀態(tài)下，Ser758位點(diǎn)的去磷酸化在ULK1的活化中并不起主導(dǎo)作用，尚存在其他協(xié)同機(jī)制，與上述機(jī)制共同作用，引起ULK1的活化進(jìn)而誘發(fā)自噬。

綜上所述，糖尿病狀態(tài)抑制創(chuàng)面組織細(xì)胞自噬，可能為糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合延遲的機(jī)制之一。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計有限，有待通過在藥物干預(yù)下對比觀察相關(guān)自噬分子的變化以進(jìn)一步證實(shí)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] ?DOSSOU A S，BASU A.The emerging roles of mTORC1 in macromanaging autophagy[J].Cancers （Basel），2019，11（10）：E1422.

[2] ?趙亞男，劉明，張玥，等.糖尿病難愈性創(chuàng)面大鼠模型的建立[J].山東醫(yī)藥，2016，56（14）：31-32.

[3] ?LIU C C，LIN Y C，CHEN Y H，et al.Cul3-KLHL20 ubiquitin ligase governs the turnover of ULK1 and VPS34 complexes to control autophagy termination[J].Mol Cell，2016，61（1）：84-97.

[4] ?麻華膽，鄭愛甜，吳標(biāo)良.細(xì)胞自噬在糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合中作用的研究進(jìn)展[J].右江醫(yī)學(xué)，2020，48（2）：81-85.

[5] ?OTRANTO M，NASCIMENTO A P D，MONTEALTOCOSTA A.Insulin resistance impairs cutaneous wound healing in mice[J].Wound Repair Regen，2013，21（3）：464-472.

[6] ?THEOCHARIDIS G，Veves A.Autonomic nerve dysfunction and impaired diabetic wound healing：The role of neuropeptides[J].Auton Neurosci，2020，223：102610.

[7] ?GONG J H，DONG J Y，XIE T，et al.The influence of AGEs environment on proliferation，apoptosis，homeostasis，and endothelial cell differentiation of human adipose stem cells[J].Int J Low Extrem Wounds，2017，16（2）：94-103.

[8] ?AHMED A S，ANTONSEN E L.Immune and vascular dysfunction in diabetic wound healing[J].J Wound Care，2016，25（Sup7）：S35-S46.

[9] ?YUAN Y J，CHEN Y N，PENG T Q，et al.Mitochondrial ROS-induced lysosomal dysfunction impairs autophagic flux and contributes to M1 macrophage polarization in a diabetic condition[J].Clin Sci，2019，133（15）：1759-1777.

[10] ?LI L F，ZHANG J H，ZHANG Q，et al.High glucose suppresses keratinocyte migration through the inhibition of p38 MAPK/autophagy pathway[J].Front Physiol，2019，10：24.

[11] ?PONTRELLI P，ORANGER A，BAROZZINO M，et al.Deregulation of autophagy under hyperglycemic conditions is dependent on increased lysine 63 ubiquitination：a candidate mechanism in the progression of diabetic nephropathy[J].J Mol Med，2018，96（7）：645-659.

[12] ?高文蔚，袁泉，江夢，等.高糖通過抑制Bmal1調(diào)控的自噬加重細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2020，51（1）：65-68.

[13] ?NAZIO F，STRAPPAZZON F，ANTONIOLI M，et al.mTOR inhibits autophagy by controlling ULK1 ubiquitylation，self-association and function through AMBRA1 and TRAF6[J].Nat Cell Biol，2013，15（4）：406-416.

[14] ?LIN S Y，LI T Y，LIU Q，et al.GSK3-TIP60-ULK1 signaling pathway links growth factor deprivation to autophagy[J].Science，2012，336（6080）：477-481.

（收稿日期：2020-04-06 修回日期：2020-05-06）

（編輯：梁明佩）