唐湘蓮 劉登輝 黎 明 肖雅玲 李 勇

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最常見的顱外惡性實(shí)體腫瘤，占所有兒童癌癥死亡人數(shù)的1／6，超過(guò)70%的NB患兒在明確診斷時(shí)已出現(xiàn)原發(fā)腫瘤外形成的惡性病變［1，2］。NB在病理學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)和臨床特征方面具有顯著的異質(zhì)性，雖然極少部分可以自發(fā)消退或分化為良性神經(jīng)節(jié)神經(jīng)瘤，但大部分呈現(xiàn)惡性進(jìn)展或?qū)Χ嗄Ｊ街委煹牡挚梗?］。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)NB患兒，如手術(shù)、高強(qiáng)度化療、放療、免疫治療以及自體干細(xì)胞移植等治療方法并未能有效提高NB的臨床療效，其5年生存率仍低于50%［4］。因此，探索NB的分子生物學(xué)特性對(duì)疾病早期診斷、治療以及預(yù)后有著極其重要的作用。

microRNAs（miRNAs）是一組內(nèi)源性、高度保守、大小為18～22個(gè)堿基的非編碼單鏈RNA分子，其在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)诙喾N人類腫瘤中呈異常表達(dá)，與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)，包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤［6，7］。據(jù)報(bào)道，與NB相關(guān)的MYCN癌基因可以通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA而起到致癌作用［8］。但也有證據(jù)表明，一些miRNA在NB的 發(fā)生過(guò) 程 中起 著 抑 癌 作 用［5，9］。miR-29家族是一類抑癌基因，成員包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，在多種惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈低表達(dá)，對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起負(fù)性調(diào)控作用［10］。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)NB組織中miR-29b的表達(dá)情況，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能，為闡明miR-29b在NB中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，以期為拓展NB的治療方法提供參考。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

收集2018年4月至2019年4月由湖南省兒童醫(yī)院普外科收治的病理診斷為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的患兒組織標(biāo)本，10例原發(fā)部位為腎上腺，2例來(lái)源于脊髓，腫塊擴(kuò)大切除后留取腫瘤組織及癌旁正常腎上腺組織，取材后立即凍存于液氮中?；純耗挲g、性別、INSS分期、術(shù)前化療情況及N-MYC的擴(kuò)增情況見表1。本研究中涉及的組織標(biāo)本均得到監(jiān)護(hù)人的知情同意，并通過(guò)本單位倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

表1 12例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的臨床特征及腫瘤組織中miR-29b表達(dá)情況Table 1 Clinical characteristics of 12 children with neuroblastoma and expression of miR-29b in tumor tissues

二、實(shí)驗(yàn)材料

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系SK-N-SH購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；miRNeasy Mini RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，MiRNA-cDNA逆轉(zhuǎn)錄劑盒及All-in-OneTMmiRNAq PCR Kit均購(gòu)自美國(guó)Gene Copoeia公司，miR-29b特異性引物購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司（序列保密）；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000購(gòu)自美國(guó)的Invitrogen公司；miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和陰性對(duì)照（NC）均購(gòu)買于上海吉瑪技術(shù)制藥有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司；E-cadherin、Vimentin及β-actin兔抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)：SK-N-SH細(xì)胞置于含有10%胎牛血清（BI，Israel）和1%雙抗（青霉素：100 U／mL；鏈霉素：0．1 mg／mL）的DMEM（BI，Israel）中培養(yǎng)，并置于含有5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。

2．實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)：利用miRNeasy Mini RNA提取試劑盒按照說(shuō)明書的要求提取組織中的miRNA，并以NanoDrop ND-2000測(cè)定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳分析提取總RNA的完整性，并取800 ng RNA以MiRNA-cDNA逆轉(zhuǎn)錄劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，選擇U6 RNA作為內(nèi)參對(duì)照。然后在All-in-OneTMqPCR Mix作用下進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序是95℃變性10 min，然后是40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（退火：60℃20 s；延伸72℃15 s）。

3．SK-N-SH細(xì)胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)試劑商（上海吉瑪）說(shuō)明轉(zhuǎn)染miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和陰性對(duì)照（NC）。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟如下：按照說(shuō)明稀釋Lipofectamine試劑，以及miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和NC試劑；制備轉(zhuǎn)染混合液，輕柔吹打混勻，室溫孵育20 min；將適量的轉(zhuǎn)染混合液加入到相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕柔搖晃混勻；將細(xì)胞置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，更換培養(yǎng)基，qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

4．CCK-8檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞活性將瞬間轉(zhuǎn)染完成12 h后的細(xì)胞接種到96孔板（5 000細(xì)胞／板），置于37℃培養(yǎng)箱中，分別在接種后的第1、2、3、4、5天加人CCK-8溶液孵育1～4 h，去除上清液加入DMSO在搖床上避光晃動(dòng)10 min后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各組吸光度值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5．劃痕實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成后，待細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)，用200μL無(wú)菌移液器槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“1”字形劃痕，用PBS洗掉脫落細(xì)胞，然后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下記錄劃痕0 h和48 h后相對(duì)距離。

6．Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞計(jì)數(shù)接種到8μm含有基質(zhì)膠的Transwell小室中（2．5×104細(xì)胞／孔），上室內(nèi)為200μL無(wú)血清培養(yǎng)基，而下室內(nèi)含有500μL 10%血清的培養(yǎng)基。放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，0．1%結(jié)晶紫染色20 min。最后在顯微鏡下觀察發(fā)生侵襲的細(xì)胞，并計(jì)算每個(gè)視野下發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)。

7．Western blot實(shí)驗(yàn)：免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和陰性對(duì)照（NC）轉(zhuǎn)染后對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，利用RIPA裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，SDSPAGE膠電泳進(jìn)行蛋白分離，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜90 min，5%的脫脂奶粉封閉1 h，免疫抗體反應(yīng)（稀釋比例為兔抗人E-cadherin 1∶1 000；兔抗人Vimentin 1∶1 000、β-actin 1∶1 000；山羊抗兔二抗1∶5 000）。ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS18．0進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理與分析。對(duì)于計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中miR-29b的表達(dá)情況

神經(jīng)母細(xì)胞瘤中miR-29b的表達(dá)水平明顯低于癌旁腎上腺組織（0．35±0．21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝18．15，P＜0．05），詳見表1。

二、miR-29b抑制SK-N-SH細(xì)胞的活性

利用CCK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示miR-29b相關(guān)核苷酸（mimics／inhibitor／NC）瞬轉(zhuǎn)入細(xì)胞第1天，miR-29b mimics即顯現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的作用，并在第3天達(dá)到抑制高峰。miR-29b mimics與miR-29b inhibitor組和NC組比較，細(xì)胞增殖能力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；但miR-29b inhibitor與NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表2。

三、miR-29b抑制SK-N-SH細(xì)胞的侵襲和遷移能力

轉(zhuǎn)染miR-29b mimics的SK-N-SH細(xì)胞發(fā)生侵襲但細(xì)胞數(shù)目（36．33±8．08）明顯少于NC組（78．67±9．07），而miR-29b inhibitor組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目（112．30±11．68）多于NC組（78．67±9．07），且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表3、圖2。體外劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor組以及NC組的SK-N-SH細(xì)胞在48 h后劃痕接近愈合，愈合率達(dá)85%以上，而轉(zhuǎn)染miR-29b mimics組的SK-N-SH細(xì)胞48 h后的劃痕明顯未愈合，愈合率僅為51．67%，見表3、圖2。

表2 miR-29b mimics和inhibitor對(duì)SK-N-SH細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 2 Effect of miR-29b mimics and inhibitor on proliferation of SK-N-SH cells（±s）

表2 miR-29b mimics和inhibitor對(duì)SK-N-SH細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 2 Effect of miR-29b mimics and inhibitor on proliferation of SK-N-SH cells（±s）

注 與NC組比較，aP＜0．05；與miR-29b inhibitor比較，bP＜0．05

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圖1 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-29b對(duì)SK-N-SH細(xì)胞侵襲能力的影響 A：NC組（倒置顯微鏡，×100）；B：miR-29b mimics組（倒置顯微鏡，×100）；C：miR-29b inhibitor組（倒置顯微鏡，×100） 圖2劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-29b對(duì)SK-N-SH細(xì)胞遷移能力的影響 A-C：劃痕后0 h；D-F：劃痕后48 h；A、D：NC組；B、E：miR-29b mimics組；C、F：miR-29binhibitor組（倒置顯微鏡，×100，與NC組相比，*P＜0．05）Fig．1 Effect of miR-29b on the invasion of neuroblastoma SK-N-SH cells was detected by Transwell test Fig．2 Effect of miR-29b on the migration of neuroblastoma SK-N-SH cells was detected by wound healing assay

表3 miR-29b對(duì)SK-N-SH細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響Table 3 Effect of miR-29b on invasion and migration of SK-N-SH cells（±s）

表3 miR-29b對(duì)SK-N-SH細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響Table 3 Effect of miR-29b on invasion and migration of SK-N-SH cells（±s）

注 與NC組比較，aP＜0．05；與miR-29b inhibitor組相比，bP＜0．05

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四、miR-29b對(duì)SK-N-SH細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響

與miR-29b inhibitor組及NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-29b mimics組的SK-N-SH細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而Vimentin表達(dá)下調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-29b inhibitor后，SK-N-SH細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而Vimentin表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)miR-29b對(duì)SK-N-SH細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)影響（與NC組相比，*P＜0．05）Fig．3 Effect of miR-29b on the expressions of E-cadherin and Vimentin in neuroblastoma SK-N-SH cells was detected by Western blotting

討 論

近年來(lái)，兒童惡性腫瘤的發(fā)病率以及因惡性腫瘤引起的病死率均呈逐年上升趨勢(shì)，已成為威脅兒童健康的重要問題。NB是嬰幼兒最常見的惡性腫瘤，最新數(shù)據(jù)表明，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致NB患兒死亡的重要原因，而NB的轉(zhuǎn)移率高達(dá)60%［11，12］。對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)NB患兒，現(xiàn)階段綜合治療的療效十分有限，且不良反應(yīng)明顯，因此探索NB發(fā)病和進(jìn)展的機(jī)制，尋找預(yù)防轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)，發(fā)展新的治療策略，對(duì)提高NB的療效具有重要意義。

miRNA是最初于1993年發(fā)現(xiàn)的大小約為18～22個(gè)堿基的非蛋白質(zhì)編碼RNA，超過(guò)60%的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)受miRNA控制，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)節(jié)作用對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可發(fā)揮重要作用［13］。研究表明，miRNA通過(guò)對(duì)腫瘤相關(guān)基因的調(diào)節(jié)在多種侵襲性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮抑制或促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-22、miR-143等與NB轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)有關(guān)［7，14］。

人類miR-29家族是一類抑癌基因，在多種人類腫瘤中異常表達(dá)，但關(guān)于其具體的作用機(jī)制目前尚不明確［15］。Cheung等［16］發(fā)現(xiàn)miR-29a在NB中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用，并可作為NB中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物。既往研究顯示，神經(jīng)祖細(xì)胞中的miR-29b表達(dá)水平明顯高于神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞［17］。Guo等［2］研究發(fā)現(xiàn)miR-29b在轉(zhuǎn)移性NB組織的表達(dá)水平升高（Fold change＝2．44）。本研究發(fā)現(xiàn)NB組織中miR-29b的表達(dá)水平明顯低于正常腎上腺組織，提示miR-29b可能參與NB的發(fā)生發(fā)展。

大量研究表明，miR-29在腫瘤發(fā)生中的作用機(jī)制復(fù)雜，表現(xiàn)出抑癌和促癌的雙重作用。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討了miR-29b對(duì)NB的作用，發(fā)現(xiàn)miR-29b mimics組中miR-29b過(guò)表達(dá)后，NB細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，侵襲、遷移能力均明顯下降，表明miR-29b在NB中發(fā)揮腫瘤抑制作用。研究表明miR-29b可調(diào)節(jié)某些細(xì)胞周期蛋白（MCL-1、CDK6、CCND2、CDC42等）來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，例如miR-29b可通過(guò)上調(diào)抑癌基因p53的表達(dá)水平，或者通過(guò)抑制p85與CDC42間接活化p53，抑制腫瘤增殖［18］。腫瘤微環(huán)境是腫瘤生長(zhǎng)、血管生成侵襲和轉(zhuǎn)移所 必 需 的［19］。Chou等［20］發(fā) 現(xiàn)GATA3可 提 高miR-29b的表達(dá)水平，并通過(guò)調(diào)節(jié)GATA3-miR-29b軸來(lái)改變腫瘤微環(huán)境，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外，miR-29b還可通過(guò)靶向調(diào)控涉及血管新生、膠原重蛋白酶解相關(guān)的轉(zhuǎn)移前動(dòng)力蛋白來(lái)抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［20］。本研究通過(guò)Transwell小室及劃痕實(shí)驗(yàn)均證實(shí)miR-29b過(guò)表達(dá)后可明顯抑制NB細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-29b過(guò)表達(dá)后E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，而Vimentin表達(dá)水平則明顯降低。Sun等［21］在肺纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-29b可以逆轉(zhuǎn)EMT，而miR-29b的下調(diào)則會(huì)促進(jìn)EMT的發(fā)生，推測(cè)這可能與miR-29b抑制TGF-β1轉(zhuǎn)錄有關(guān)。Li等［22］在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，miR-29b缺失會(huì)促進(jìn)EMT，增加癌細(xì)胞的侵襲性。Ru等［23］發(fā)現(xiàn)miR-29b可以通過(guò)調(diào)節(jié)EMT信號(hào)傳導(dǎo)抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移，當(dāng)前列腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-29b后，上皮標(biāo)志物Ecadherin表達(dá)增強(qiáng)，而N-cadherin、Twist和Snail表達(dá)下降。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，提示miR-29b可通過(guò)促進(jìn)EMT過(guò)程中的上皮轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制NB侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究通過(guò)分析NB中miR-29b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-29b在NB組織表達(dá)下調(diào)，并初步驗(yàn)證了miR-29b對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖以及轉(zhuǎn)移的影響，這些結(jié)果為闡明NB的發(fā)病機(jī)制提供了新的視野，為發(fā)展NB的治療新策略提供了一定的理論依據(jù)。在接下來(lái)的研究中，我們將進(jìn)一步探討miR-29b抑制NB侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并通過(guò)建立NB的人源腫瘤異種移植模型（PatientDerived tumor Xenograft，PDX）及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)深入研究miR-29b對(duì)NB成瘤及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。