胡盼盼

（1.呂梁學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 呂梁033000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 晉中030801）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌[1-3]，能夠?qū)⑻妓衔锇l(fā)酵成乳酸，具有降低膽固醇、抗氧化等生物活性[4-5]。LAB在生長代謝過程中能夠生產(chǎn)兩類胞外多糖（expolysaccharides，EPS），一類是由同一種單糖組成的同多糖（homopolysaccharide，HoPS）；一類是由含有兩個以上不同單糖的重復(fù)單元組成的雜多糖（heteropolysaccharide，HePS）[7-9]。LAB產(chǎn)生的EPS無毒、能夠調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群、保持微生態(tài)平衡、降低血清膽固醇、抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長繁殖，制造營養(yǎng)物質(zhì)、刺激組織發(fā)育，從而對機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、細(xì)胞感染、腫瘤反應(yīng)和突然的應(yīng)急反應(yīng)等產(chǎn)生作用[10-12]，常被用作功能性食品成分。此外，還作為天然添加劑如增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、起泡劑和凝膠劑等應(yīng)用于食品、化工和醫(yī)藥領(lǐng)域[6]。

近幾十年來，由于微生物胞外多糖在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、性能及生產(chǎn)方面所具有的特別優(yōu)勢而得到大力研究開發(fā)[13-14]。同時，乳酸菌又是食品級工業(yè)生產(chǎn)菌，與其他菌相比安全性高，所以近年來對乳酸菌胞外多糖的研究逐漸增多。但是除了腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）所產(chǎn)的右旋糖酐現(xiàn)已工業(yè)化以外，產(chǎn)量低，菌株穩(wěn)定性差仍是制約乳酸菌胞外多糖廣泛應(yīng)用的首要因素，因此需要不斷摸索各種方法來提高乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量[15-17]。

本研究以副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L為研究對象，采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對其產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對胞外多糖的抗腫瘤活性進(jìn)行初步研究，對乳酸菌胞外多糖更加廣泛的應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與細(xì)胞

副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei）M5L：由哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系從新疆馬奶酒中分離鑒定[11]；Caco-2細(xì)胞：中國科學(xué)院。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：北京畢特博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；杜氏改良Eagle（Dulbecco's modified Eagle，DEME）培養(yǎng)基：上海玉博生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑

胎牛血清：賽業(yè)生物科技有限公司；無水乙醇、三氯乙酸、硫酸、苯酚、正丁醇、二甲基亞砜、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、濃硫酸、葡萄糖等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S-1-150S高速離心機(jī)：德國Sigma公司；VS-502FD凍干機(jī)：河南?？藸杻x器儀表有限公司；BPN-50CHUV細(xì)胞培養(yǎng)箱：濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；CKX53倒置顯微鏡：南京衡橋儀器有限公司；CT115C滅菌鍋：姜堰市新康醫(yī)療器有限公司；GH86超凈工作臺：蘇州博立斯凈化科技有限公司；InfiniteM200酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌胞外多糖的生產(chǎn)

將凍存的乳酸菌M5L干粉接種于MRS液體培養(yǎng)基中，42 ℃條件下培養(yǎng)10 h，活化兩代使其恢復(fù)活力，得到發(fā)酵種子液（109CFU/mL）。按照2%（V/V）的接種量將種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，37 ℃條件下發(fā)酵8 h。

1.3.2 乳酸菌胞外多糖的提取及檢測

發(fā)酵液經(jīng)100 ℃串氣滅酶活，10 000 r/min離心20 min，去除菌體，加入10%的三氯乙酸，4 ℃靜置隔夜，12 000 r/min離心30 min，除去蛋白，再加入3倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4 ℃靜置隔夜，12 000 r/min離心20 min，得到多糖沉淀，雙蒸水（ddH2O）溶解多糖后，采用苯酚-硫酸法對多糖含量進(jìn)行測定，最后將糖液冷凍干燥備用[18-19]。

1.3.3 乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

初始pH值的優(yōu)化：按2%（V/V）的接種量將乳酸菌M5L種子液接種于初始pH值分別為4.5、5.5、6.5、7.5和8.5的MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，在37 ℃條件下分別發(fā)酵8 h，提取胞外多糖并對胞外多糖含量進(jìn)行測定。

菌體濃度的優(yōu)化：按2%（V/V）的接種量將菌體濃度分別為105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL的乳酸菌M5L菌液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，初始pH值為7.5，裝液量為100 mL/250 mL，在37 ℃條件下分別發(fā)酵8 h，提取胞外多糖并對胞外多糖含量進(jìn)行測定。

發(fā)酵溫度的優(yōu)化：按2%（V/V）的接種量將乳酸菌M5L種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，初始pH值為7.5，裝液量為100 mL/250 mL，分別在25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃條件下發(fā)酵8 h，提取胞外多糖并對胞外多糖含量進(jìn)行測定。

發(fā)酵時間的優(yōu)化：按2%（V/V）的接種量將乳酸菌M5L種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，初始pH為7.5，裝液量為100 mL/250 mL，在37 ℃條件下分別發(fā)酵8 h、12 h、24 h、36 h和48 h，提取胞外多糖并對胞外多糖含量進(jìn)行測定。

1.3.4 乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、菌體濃度（C）、初始pH值（D）為考察因素，以胞外多糖產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）法進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，對乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖濃度發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of exopolysaccharides by lactic acid bacteria

1.3.5 乳酸菌胞外多糖抗腫瘤活性的測定

噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法[11]：調(diào)整Caco-2的細(xì)胞濃度為106個/mL到96孔板中，分別加入質(zhì)量濃度為0 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL和750 μg/mL的乳酸菌胞外多糖。每個質(zhì)量濃度5個平行。在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL PBS清洗兩次，然后每孔中加入0.5 mg/mL的MTT 100 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出MTT后每孔中加入150 μL二甲基亞砜，置于搖床振蕩10 min，最后用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測定吸光度值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率，其計(jì)算公式如下：

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQPCR）[20]：采用乳酸菌胞外多糖孵育Caco-2細(xì)胞72 h后，采用Trizol法提取Caco-2細(xì)胞的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementaryDNA，cDNA）。再以cDNA為模板，進(jìn)行RT-FQPCR擴(kuò)增，檢測Caco-2細(xì)胞中抑凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax和Caspase-3信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表達(dá)水平。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 8.0、Design Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 初始pH值對乳酸菌胞外多糖得率產(chǎn)量的影響

菌體生長需要適宜的pH值，初始pH值可以通過影響菌體生長進(jìn)而影響多糖產(chǎn)量。不同初始pH值對乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖的影響見圖1。由圖1可知，隨著初始pH值的增加，乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)初始初始pH值為7.5時，胞外多糖產(chǎn)量最高，為127.7 mg/mL，說明過酸過堿均可影響菌體胞外多糖的產(chǎn)量。因此，確定最佳初始pH值為7.5。

圖1 初始pH值對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of initial pH on exopolysaccharides yield

2.1.2 菌體濃度對乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的影響

接種量可以直接影響單位發(fā)酵液中的菌體數(shù)量，從而影響最終胞外多糖的產(chǎn)量。不同菌體濃度對乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖的影響見圖2。

圖2 菌體濃度對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effect of cell concentration on exopolysaccharides yield

由圖2可知，隨著菌體濃度不斷增加，胞外多糖產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)菌體濃度為108CFU/mL時，胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高，為131.2 mg/mL。因此，選擇最佳菌體濃度為108CFU/mL。

2.1.3 發(fā)酵溫度對乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的影響

溫度是影響胞外多糖發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素，不同發(fā)酵溫度對乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時，乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高，為132.7 mg/mL。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on exopolysaccharides yield

2.1.4 發(fā)酵時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵時間對乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖的影響見圖4。由圖4可知，發(fā)酵時間對乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖影響較大，當(dāng)發(fā)酵時間為12 h時，乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量達(dá)到最高，為147.1 mg/mL。隨后產(chǎn)量降低，這可能是由于培養(yǎng)基碳源的含量減少，導(dǎo)致菌體消耗自身產(chǎn)的多糖所致。因此，確定最佳發(fā)酵時間為12 h。

圖4 發(fā)酵時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on exopolysaccharides yield

2.2 乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時間（B）、菌體濃度（C）及初始pH值（D）為考察因素，胞外多糖產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3平響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization of exopolysaccharides by lactic acid bacteria M5L

根據(jù)表2所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Desigh-Expert 8.0.6進(jìn)行多元回歸擬合，得到乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量對試驗(yàn)因素的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=161.50+9.67A+1.99B+10.60C+32.28D+5.40AB+9.33AC-2.02AD-8.38BC+1.20BD+8.90CD-22.59A2-18.20B2-25.21C2-18.98D2。

方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對值的大小可以直接反映各因素對響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)號則反映了影響的方向。由二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)可知方程所代表的拋物線開口向下，因此方程有極大值，可以用來優(yōu)化分析。由方程的一次項(xiàng)系數(shù)可以得出，影響乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖的因素依次為初始pH值＞菌體濃度＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，方程的模型的P值＜0.000 1，極顯著，說明模型有意義；失擬項(xiàng)P值=0.646 1＞0.05，不顯著；即模型與試驗(yàn)值之間的誤差較??；決定系數(shù)R2=0.982 2，說明此模型可以解釋98.22%的數(shù)據(jù)；變異系數(shù)（variable coefficient，CV）=4.57%，CV值較小，說明試驗(yàn)誤差較小。此外，一次項(xiàng)A、C、D及二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AC、AD、BC及CD對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而其他項(xiàng)對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。通過F值可知，影響乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖的因素的主次順序?yàn)槌跏紁H值＞菌體濃度＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間，與模型中回歸線性方程的分析相吻合。

2.2.2 響應(yīng)面分析圖

各因素交互作用對乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖的影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

由圖5可知，所有響應(yīng)面開口均朝下，存在極大值。胞外多糖含量均隨發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH值及菌體濃度的變化呈先增大后減小的趨勢，且各因素極大值分別為發(fā)酵時間12 h、發(fā)酵溫度37 ℃、初始pH值7.5、菌體濃度108CFU/mL。

圖5 各因素間交互作用對胞外多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on exopolysaccharides yield

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分析，確定乳酸菌M5L產(chǎn)胞外多糖的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵溫度37.19 ℃，初始pH值7.72，菌體濃度108.31CFU/mL，發(fā)酵時間12.79 h。胞外多糖產(chǎn)量的最大預(yù)測值為167.5 mg/mL。根據(jù)實(shí)際情況，將最優(yōu)條件修訂為發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間12.8 h，初始pH值7.7，菌體濃度108CFU/mL，在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，進(jìn)行三組驗(yàn)證性試驗(yàn)，胞外多糖平均產(chǎn)量實(shí)際值為167.2 mg/mL，與預(yù)測值之間擬合較好，誤差在允許范圍內(nèi)，說明利用響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果分析是可行的、有效的。

2.3 乳酸菌胞外多糖抗腫瘤活性的測定

2.3.1 MTT試驗(yàn)結(jié)果

采用MTT法測定乳酸菌胞外多糖的抗腫瘤活性，結(jié)果見圖6。

圖6 噻唑藍(lán)法乳酸菌胞外多糖抗腫瘤活性測定結(jié)果Fig. 6 Determination results of antitumor activity of exopolysaccharides of lactic acid bacteria by methyl thiazolyl tetrazolium method

由圖6可知，乳酸菌胞外多糖對腫瘤細(xì)胞的抑制率呈現(xiàn)出時間和質(zhì)量濃度依賴性，即時間越長，質(zhì)量濃度越大，對Caco-2細(xì)胞的抑制效果越好。胞外多糖作用于Caco-2細(xì)胞72 h后，其腫瘤細(xì)胞抑制率顯著高于作用24 h和48 h，且當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL和750 μg/mL處理72 h后，腫瘤抑制率相差不大。因此，選擇質(zhì)量濃度為500 μg/mL的胞外多糖作用72 h用于后續(xù)的研究。

2.3.2 RT-FQPCR結(jié)果

以未經(jīng)胞外多糖處理的Caco-2細(xì)胞為對照，采用RTFQPCR測定經(jīng)質(zhì)量濃度為500 μg/mL的胞外多糖作用72 h后的Caco-2細(xì)胞中的促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Caspase-3的表達(dá)量，結(jié)果見圖7。

圖7 Caco-2細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量Fig. 7 Expression quantity of apoptosis-related gene in Caco-2 cells

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡過程中重要的凋亡蛋白之一，其蛋白家族中的Bax蛋白具有促進(jìn)凋亡的作用，Bcl-2蛋白可以抑制細(xì)胞的凋亡[11]。Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在人類細(xì)胞中Caspase-3的超量表達(dá)和激活均會引起細(xì)胞凋亡，因此，又稱死亡蛋白酶[11]。由圖7可知，與未經(jīng)乳酸菌胞外多糖處理的對照組相比，乳酸菌胞外多糖處理組可以顯著提高Caco-2細(xì)胞中促凋亡基因Bax的表達(dá)量（P＜0.05），顯著降低抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)量（P＜0.05），因此Bax/Bcl-2比值變大，且Caco-2細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），說明乳酸菌M5L所產(chǎn)胞外多糖可通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)Caco-2細(xì)胞凋亡。

3 結(jié)論

采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間12.8 h，初始pH值7.7，菌體濃度為108CFU/mL。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，胞外多糖產(chǎn)量為167.2 mg/mL，是優(yōu)化前（128.3 mg/mL）的1.3倍。該胞外多糖可通過影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)Caco-2細(xì)胞凋亡，當(dāng)質(zhì)量濃度為500 μg/mL的胞外多糖作用于Caco-2細(xì)胞72 h時，腫瘤抑制率達(dá)到19.5%。