肖飛 辛士永 邵長帥 張建國 高中偉

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率逐年上升。因此，揭示膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找早期診斷和治療靶點極具意義。微小RNAs（microRNAs，miRNAs/miR）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，在膀胱癌等腫瘤中扮演著重要角色［1-3］。證據(jù)表明，微小RNA-182-5p（microRNA-182-5p，miR-182-5p）在膀胱癌細胞中低表達，上調(diào)其表達可抑制癌細胞增殖和遷移侵襲［4］。但miR-182-5p 參與膀胱癌細胞增殖和侵襲遷移的分子機制尚不明確。生物學(xué)信息軟件預(yù)測出miR-182-5p 可能靶向同源異型盒基因B7（homeobox B7 gene，HOXB7），并且資料顯示，HOXB7在皮膚鱗狀細胞癌細胞中高表達，沉默miR-182-5p 抑制癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移［5］。而miR-182-5p 是否通過靶向HOXB7 調(diào)控膀胱癌細胞的增殖和侵襲遷移，這方面的研究鮮見報道。因此，本研究考察miR-182-5p 對膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響，旨在闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑和儀器

正常膀胱上皮細胞（SV-HUC-1，HUU）和膀胱癌細胞（T24、5637、SW780）購自美國ATCC 公司，miR-182-5p 模擬物、陰性對照質(zhì)粒（miR-NC）、熒光素酶報告載體購自上海吉瑪生物有限公司，HOXB7、P53、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases2，MMP-2）蛋白抗體購自美國Cellular Signaling Technology 公 司。ABI 7500 熒 光 定 量PCR 儀購自美國Applied Biosystems 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

HUC、T24、5637、SW780 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 實時熒光定量PCR 檢測目的基因表達

采用Trizol 試劑提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），按照qPCR 試劑盒說明書進行反應(yīng)。條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，40 個循環(huán)。收集Ct 值，以2-ΔΔCt法計算miR-182-5p、HOXB7 mRNA 相對表達量。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）

細胞中加入蛋白裂解液提取總蛋白，經(jīng)10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，常溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光液進行顯色、曝光，以β-actin 為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染、增殖

將SW780 細胞接種于6 孔板，生長至70%融合度，按照Lipofectamine 2000 試劑說明書的指示，將miR-182-5p、anti-miR-182-5p、si-HOXB7及相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染入細胞。

收集轉(zhuǎn)染后的SW780 細胞，以1×104個/孔的密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，每孔加入100 μL MTT 溶液，37℃孵育4 h，加入200 μL 二甲基亞砜，搖床孵育10 min，酶標儀檢測細胞在490 nm 處的吸光度值（OD490nm值）。

1.6 Transwell 小室法檢測細胞遷移和侵襲能力

細胞侵襲實驗中，將Matrigel 膠與無血清培養(yǎng)基混勻，加入Transwell 上室。細胞用無血清培養(yǎng)基調(diào)整為5×105個/mL，吸取100 μL 于上室。下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)48 h后，用無菌棉簽除去多余細胞和Matrigel 膠，甲醛固定和結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照、計數(shù)。

細胞遷移實驗中，Transwell 上室不加入Matrigel 膠，其余步驟與侵襲實驗相同。

1.7 靶基因預(yù)測及雙熒光素酶基因報告

利用TargetScan（http：//www.targetscan.org/）軟件篩選出miR-182-5p 與HOXB7的3'非編碼區(qū)（3'untranslated region，3'UTR）區(qū)域具有部分結(jié)合位點。為了證實miR-182-5p 與HOXB7是否存在靶向關(guān)系，分別構(gòu)建野生型HOXB7（HOXB7-WT）和突變型HOXB7（HOXB7-MUT）的3'UTR 熒光素酶報告載體，并分別共轉(zhuǎn)染miR-182-5p 模擬物，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，收集細胞，測定雙熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-182-5p 和HOXB7 在正常膀胱上皮HUC細胞與膀胱癌細胞T24、5637、SW780 中的表達

與HUC 細胞相比，T24、5637、SW780 細胞中miR-182-5p 表達量顯著減少，HOXB7mRNA 和蛋白表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）見表1。

表1 miR-182-5p 和HOXB7 在正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞中的表達（±s，n=9）Table 1 Expressions of miR-182-5p and HOXB7 in normal bladder epithelial cells and bladder cancer cells（±s，n=9）

表1 miR-182-5p 和HOXB7 在正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞中的表達（±s，n=9）Table 1 Expressions of miR-182-5p and HOXB7 in normal bladder epithelial cells and bladder cancer cells（±s，n=9）

分組HUC T24 5637 SW780 F 值P 值miR-182-5p 1.00±0.14 0.46±0.04a 0.58±0.07a 0.41±0.05a 90.409 0.000 HOXB7 mRNA 1.00±0.12 4.16±0.35a 3.88±0.41a 5.82±0.39a 315.752 0.000 HOXB7 蛋白0.29±0.05 0.73±0.05a 0.67±0.06a 0.88±0.08a 151.260 0.000

2.2 過表達miR-182-5p 對SW780 細胞增殖、遷移和侵襲的影響

與miR-con 組比較，過表達miR-182-5p 降低SW780 細胞活力，且在48 h 和72 h 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與miR-con 組比較，過表達miR-182-5p 顯著降低SW780 細胞的遷移、侵襲數(shù)（P<0.05）（圖1A），P53 和MMP-2 蛋白的表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。圖1B、見表2。

圖1 過表達miR-182-5p 對SW780 細胞遷移、侵襲和相關(guān)蛋白表達的影響（CVS，×100）Figure 1 Effects of overexpression of miR-182-5p on migration，invasion and related protein expressions of SW780 cells（CVS，×100）

表2 過表達miR-182-5p 對SW780 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 2 Effects of overexpression of miR-182-5p on cell proliferation，migration and invasion in SW780 cells（±s，n=9）

表2 過表達miR-182-5p 對SW780 細胞增殖、遷移和侵襲的影響（±s，n=9）Table 2 Effects of overexpression of miR-182-5p on cell proliferation，migration and invasion in SW780 cells（±s，n=9）

分組miR-con miR-182-5p t 值P 值miR-182-5p 1.00±0.08 3.61±0.36 21.232 0.000細胞活力（OD490 nm）24 h 0.44±0.04 0.42±0.06 0.832 0.418 48 h 0.71±0.07 0.59±0.06 4.992 0.000 72 h 1.05±0.13 0.77±0.08 5.503 0.000細胞遷移數(shù)（個）107.65±11.27 39.26±4.53 16.892 0.000細胞侵襲數(shù)（個）48.28±5.64 18.64±4.71 12.101 0.000 P53 蛋白0.53±0.07 0.28±0.05 8.719 0.000 MMP-2 蛋白0.67±0.06 0.38±0.07 9.437 0.000

2.3 miR-182-5p 靶向調(diào)控HOXB7 表達

TargetScan 網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)HOXB7的3'UTR中含有與miR-182-5p 互補的核苷酸序列（圖2A）。轉(zhuǎn)染miR-182-5p 模擬物明顯降低HOXB7表達水平，轉(zhuǎn)染anti-miR-182-5p 模擬物顯著提高HOXB7 表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2B）。雙熒光素酶基因報告實驗發(fā)現(xiàn)，miR-182-5p 顯著抑制野生型HOXB7（HOXB7-WT）報告基因的熒光素酶相對活性（P<0.05），而對突變型HOXB7（HOXB7-MUT）熒光素酶相對活性無顯著影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.4 抑制HOXB7 表達對SW780 細胞增殖、遷移和侵襲的作用

在SW780 細胞中轉(zhuǎn)染si-HOXB7載體，與si-con 組相比，si-HOXB7組細胞中HOXB7 表達量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與si-con 組比較，si-HOXB7組SW780 細胞活力在48、72 h 時顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），P53 和MMP-2 的蛋白表達量顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），細胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3、表4。

圖2 miR-182-5p 靶向調(diào)控HOXB7 蛋白表達Figure 2 miR-182-5p targeted and regulated HOXB7 protein expression

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Table 3 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

表3 雙熒光素酶報告實驗（±s，n=9）Table 3 Dual luciferase reporter experiment（±s，n=9）

分組miR-con miR-182-5p t 值P 值HOXB7-WT 1.00±0.13 0.59±0.06 8.591 0.000 HOXB7-MUT 0.98±0.07 1.08±0.13 2.032 0.059

圖3 Western blot 檢測SW780 細胞HOXB7、P53 和MMP-2 蛋白表達Figure 3 Western blot analysed expressions of HOXB7，proliferation and migration-related protein in SW780 cells

2.5 過表達HOXB7 逆轉(zhuǎn)了miR-182-5p 對SW780細胞增殖、遷移和侵襲的作用

與miR-con 相比，過表達miR-182-5p 顯著影響48 h 和72 h 的SW780 細胞活力、細胞遷移、侵襲數(shù)目、P53 和MMP-2 表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與2.2 研究結(jié)果相同。另外，過表達miR-182-5p 還減少HOXB7 表達量。與共轉(zhuǎn)染miR-182-5p 和pcDNA 相比，共轉(zhuǎn)染miR-182-5p和pcDNA-HOXB7顯著提升HOXB7、P53 和MMP-2 蛋白表達水平以及細胞遷移、侵襲數(shù)目（P<0.05），以及提高SW780 細胞活力，在48、72 h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4和表5。

圖5 SW780 細胞HOXB7、增殖和遷移相關(guān)蛋白表達Figure 5 Expressions of HOXB7,proliferation and migration-related protein in SW780 cells

3 討論

miRNAs 通過與互補信使RNA 的3’UTR 特異性結(jié)合來調(diào)控基因表達，影響細胞功能和多種生物學(xué)過程［6-8］，可作為癌癥早期診斷和治療的生物標志物，在膀胱癌等癌癥中具有良好的應(yīng)用價值［9-10］。既往研究表明，在不同類型的癌癥中，miR-182-5p 作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮生物學(xué)功能。一方面，扮演癌基因的角色促進細胞增殖或轉(zhuǎn)移，如miR-182-5p 在口腔鱗狀細胞癌中表達上調(diào)；促進口腔鱗癌細胞增殖［11］。胃癌組織和細胞系中miR-182-5p 表達上調(diào)；miR-182-5p 下調(diào)了降低胃癌細胞的活力、遷移、侵襲和有絲分裂［12］。另一方面，miR-182-5p 作為抑癌基因，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，如miR-182-5p 在卵巢癌中表達下調(diào)，其上調(diào)導(dǎo)致卵巢癌細胞的增殖、克隆形成和遷移能力受到抑制［13］。在結(jié)直腸癌中，miR-182-5p 表達顯著下調(diào)；結(jié)直腸癌SW620 細胞的增殖、侵襲和遷移能力被miR-182-5p 過表達所抑制，miR-182-5p 顯現(xiàn)出抗癌作用［14］。本項實驗發(fā)現(xiàn)，與卵巢癌［13］、結(jié)直腸癌［14］相同，miR-182-5p 在膀胱癌細胞系中的表達下調(diào)。過表達miR-182-5p 抑制膀胱癌SW780 細胞活力、遷移和侵襲能力，與Wang 等［4］研究相同。

表4 抑制HOXB7 表達對SW780 細胞增殖、遷移和侵襲的作用（±s，n=9）Table 4 Inhibition of HOXB7 expression on proliferation，migration and invasion of SW780 cells（±s，n=9）

表4 抑制HOXB7 表達對SW780 細胞增殖、遷移和侵襲的作用（±s，n=9）Table 4 Inhibition of HOXB7 expression on proliferation，migration and invasion of SW780 cells（±s，n=9）

分組si-con si-HOXB7 t 值P 值細胞活力（OD490 nm）24 h 0.42±0.04 0.38±0.05 1.874 0.079 48 h 0.68±0.05 0.45±0.04 10.776 0.000 72 h 1.09±0.07 0.76±0.08 9.313 0.000細胞遷移數(shù)（個）113.69±13.19 42.53±8.55 13.581 0.000細胞侵襲數(shù)（個）53.47±6.16 25.29±4.29 11.262 0.000 HOXB7 蛋白0.88±0.08 0.27±0.06 18.300 0.000 P53 蛋白0.63±0.07 0.31±0.08 9.031 0.000 MMP-2 蛋白0.74±0.08 0.37±0.06 11.100 0.000

表5 過表達HOXB7 逆轉(zhuǎn)了miR-182-5p 對SW780 細胞增殖、遷移和侵襲的作用（±s，n=9）Table 5 Overexpression of HOXB7 reversed the effects of miR-182-5p on proliferation，migration and invasion of SW780 cells（±s，n=9）

表5 過表達HOXB7 逆轉(zhuǎn)了miR-182-5p 對SW780 細胞增殖、遷移和侵襲的作用（±s，n=9）Table 5 Overexpression of HOXB7 reversed the effects of miR-182-5p on proliferation，migration and invasion of SW780 cells（±s，n=9）

注：與miR-con 組比較，aP＜0.05；與miR-182-5p+pcDNA 組比較，bP＜0.05。

分組miR-con miR-182-5p miR-182-5p+pcDNA miR-182-5p+pcDNA-HOXB7 F 值P 值細胞活力（OD490 nm）24 h 0.43±0.04 0.39±0.04 0.40±0.05 0.41±0.05 1.281 0.298 48 h 0.72±0.07 0.47±0.05a 0.51±0.05 0.66±0.04b 44.452 0.000 72 h 1.10±0.09 0.67±0.06a 0.74±0.06 0.96±0.09b 60.449 0.000細胞遷移數(shù)（個）109.38±10.24 38.63±3.58a 49.56±4.17 72.46±10.83b 139.513 0.000細胞侵襲數(shù)（個）58.04±5.28 18.47±4.35a 21.69±3.37 41.29±4.73b 152.102 0.000 HOXB7蛋白0.69±0.06 0.45±0.06a 0.49±0.06 0.62±0.06b 65.079 0.000 P53 蛋白0.72±0.05 0.42±0.04a 0.45±0.05 0.57±0.06b 40.324 0.000 MMP-2蛋白0.74±0.08 0.35±0.04a 0.31±0.05 0.64±0.06b 115.234 0.000

本實驗發(fā)現(xiàn)，HOXB7mRNA 和蛋白表達在膀胱癌中表達上調(diào)，提示HOXB7可能參與膀胱癌進程。HOXB7是同源異形盒基因（homeobox gene，Hox）家族成員之一，與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Huan 等［15］和Huo 等［16的研究表明，HOXB7在肝癌、膠質(zhì)瘤的表達上調(diào)，下調(diào)HOXB7表達會抑制肝癌、膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。這些結(jié)果說明HOXB7具有致癌作用，可以促進癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。本項實驗同樣證實了這一觀點，即HOXB7對膀胱癌進程具有一定的促進作用，抑制HOXB7表達可以抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲。

在不同的腫瘤中，多個基因已被證實為miR-182-5p 的直接靶標，如絲切蛋白1（cofilin 1，CFL1）［2］、異粘蛋白（Metadherin，MTDH）［14］等。本實驗結(jié)果證明miR-182-5p 抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用可能是通過靶向調(diào)控HOXB7表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-182-5p 可以通過靶向調(diào)控HOXB7的表達，從而影響膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這為膀胱癌提供了新的治療靶點和生物標志物。