郭玉巖，李春成，王力勛，孫 爽，楊大宇，呂邵娃

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

復(fù)方洋金花軟膏是在具有明確臨床療效的黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑復(fù)方洋金花軟膠囊[1]基礎(chǔ)上，二次開發(fā)的新型外用制劑，處方由洋金花和冰片兩味藥材組成。課題組前期研究表明，復(fù)方洋金花制劑不僅對小鼠陰道上皮細胞有絲分裂有明顯抑制作用，并且可以促進其尾部鱗片顆粒層的形成，表現(xiàn)出明顯的抗增殖及促進皮膚角化作用，可有效拮抗銀屑病的病程發(fā)展[2]。但由于洋金花中存在的生物堿類成分具有類麻醉作用[3]，口服給藥存在一定的風(fēng)險，為此，選擇合理的復(fù)方洋金花外用制劑來治療銀屑病具有重要的意義。

冰片是復(fù)方洋金花軟膏的重要組成，其具有清熱解痛、防腐生肌、抗菌、抗炎等功效[1]，同時由于其自身固有促透特性，可加速藥物的經(jīng)皮吸收。目前，常用的冰片以合成冰片為主，成分由龍腦和異龍腦組成[4]，均具有揮發(fā)性，這為復(fù)方制劑放置過程中的質(zhì)量穩(wěn)定性帶來風(fēng)險，為此，本研究建立了以龍腦和異龍腦為指標的氣相色譜法，為復(fù)方制劑中冰片的質(zhì)量控制提供準確、可靠的方法，進而保證臨床用藥的有效性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7960型氣相色譜儀(FID檢測器)（美國，安捷倫公司）；AL204、AB265-S型電子分析天平（瑞士，METTLER-TOLEDO公司）；KQ-5200DB型超數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

洋金花軟膏（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號2018 1203）；冰片對照品（批號：112793-201705，純度＞98.0%）、水楊酸甲酯對照品（批號：110707-201011，純度＞98.0%）均購自于中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent7960型氣相色譜儀（FID檢測器），氣相毛細管柱（30m×0.25mm），毛細管柱初始溫度為80℃，以5℃·min-1的升溫速度升至柱溫140℃，以10℃·min-1的升溫速度升至220℃。前進樣口溫度與前檢測器溫度均為200℃，載氣為N2，體積流量1.0mL·min-1；進樣量 1μL，分流比為 10∶1，定量法為內(nèi)標法。峰分離度符合要求，理論塔板數(shù)按龍腦記應(yīng)不低于10000，冰片含量按龍腦和異龍腦總量計。

2.2 內(nèi)標液的制備

取水楊酸甲酯對照品適量，精密稱定，用無水乙醇溶解并稀釋成5mg·mL-1的溶液，作為內(nèi)標溶液。

2.3 對照品制備

取冰片對照品約5mg，精密稱定，置10mL量瓶中，精密加入內(nèi)標溶液2mL，加無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.4 供試品的制備

取洋金花軟膏約1g，精密稱定，置25mL量瓶中，加入無水乙醇10mL，超聲振搖處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放置至室溫，精密加入內(nèi)標液5mL，加無水乙醇至刻度搖均勻、濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.5 陰性液制備

取洋金花軟膏空白基質(zhì)，按照供試品制備方法進行制備，得到陰性液。

2.6 專屬性實驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各1μL，在“2.1”項色譜條件下分析，結(jié)果洋金花軟膏中龍腦、異龍腦及內(nèi)標物水楊酸甲酯峰分離良好，峰形對稱，樣品中的其他成分對這2種指標成分測定無干擾，見圖1。

圖1 洋金花軟膏GC色譜圖Fig.1 GC flower chromatogram of datura flower ointment 1.isoborne brain 2.borneol 3.methyl salicylate A.borneol reference medicine B.YangJinhua ointment sample C.ointment negative liquid gas chromatogram

2.7 線性關(guān)系考察

精密稱取冰片對照品8.13mg置于10mL量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準品儲備液；再分別移取儲備液適量，加入內(nèi)標液 2mL，配 制 成 冰 片 濃 度 為 162.6、325.2、406.5、487.8、813μg·mL-1照上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，并以冰片對照品的濃度（mg·mL-1）為橫坐標，冰片峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。得冰片回歸方程為Y=5.1051X+0.0027（R2=0.9998），以上結(jié)果表明：在 162.6～813μg·mL-1范圍內(nèi)冰片線性關(guān)系良好。

圖2 冰片的標準曲線圖Fig.2 Standard curve of borneol

2.8 精密度試驗

取對照品溶液，照“2.1氣相色譜條件”，連續(xù)進樣6次，記錄龍腦、異龍腦峰面積之和與內(nèi)標液的比值，并分別計算其RSD值，RSD值為1.91%，表明該儀器精密度良好。結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗Tab.1 Precision test

2.9 穩(wěn)定性試驗

按“2.4”項下制備供試品溶液，于室溫條件下放置 0、1、2、4、8、12h 后，按上述色譜條件進行測定，記錄龍腦、異龍腦峰面積之和與內(nèi)標液的比值，RSD值為1.87%，該供試品在12h內(nèi)穩(wěn)定，表明本方法穩(wěn)定性良好。結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗Tab.2 Stability test

2.10 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批供試品6份，精密稱定重量，按“2.4”項下制備供試品溶液測定，記錄龍腦、異龍腦峰面積之和與內(nèi)標液的比值。結(jié)果冰片含量的RSD值1.26%，表明該方法重復(fù)性良好。結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗Tab.3 Repeatability test

2.11 加樣回收率實驗

取已知含量的同一洋金花軟膏9份，分別加入冰片對照品溶液（5.14mg·mL-1），使成低、中、高 3 個濃度，按照樣品溶液制備方法制備，進樣1μL，記錄龍腦、異龍腦峰面積之和與內(nèi)標液的比值，計算平均回收率為98.67%，RSD為2.41%，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests

2.12 耐用性實驗

按上述色譜條件，分別在改變色譜柱、柱溫、流速等條件下注入液相色譜儀，比較峰面積并進行色譜峰的系統(tǒng)評價。

表5 冰片耐用性實驗Tab.5 Borneze durability test

2.13 樣品的含量測定及限度的制定

取10個批號洋金花軟膏，按上述供試品溶液制備方法制備樣品，每個批號平行2份，取1μL進樣，依法測定，計算洋金花軟膏中冰片的含量。結(jié)果十批洋金花軟膏中冰片的的平均含量為9.67mg·g-1，考慮藥材來源、軟膏制備過程等因素，結(jié)合十批樣品測定結(jié)果，在此實驗結(jié)果基礎(chǔ)上下浮20%為其含量限度，即洋中金花軟膏中以冰片含量計，不得少于7.74mg·g-1，結(jié)果見表 6。

表6 10批樣品中冰片含量Tab.6 Content of borneol in 10 batches

3 討論

（1）本復(fù)方制劑工藝中所采用的基質(zhì)大多為油溶性基質(zhì)，制劑具有較強的粘稠性，難以分散，為將所含冰片完全提取，本研究分別考察了甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯3種不同溶劑對樣品進行超聲提取[5]，結(jié)果采用無水乙醇提取時，制劑中的待測成分提取較為完全；進一步對超聲功率、時間進行優(yōu)化，結(jié)果在40kHz、30min條件下，提取最為完全，提取回收率為96.89%。

（2）目前，用GC法測定冰片含量有恒溫測定法和程序升溫法[6]，相比恒溫測定，程序升溫能夠加快高沸點物質(zhì)出峰時間[7]，減小擴散，而對于前面組分也會有更大的保留，利于分離[8]，故本研究采用程序升溫法；以水楊酸甲酯為內(nèi)標物，以無水乙醇為提取溶劑作為測定條件。結(jié)果冰片中龍腦和異龍腦的的分離度均符合要求，峰型良好，出峰時間較理想，表明建立的方法準確、可靠，且簡單、迅速，適宜于該產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控。測定結(jié)果以龍腦和異龍腦之和進行計算。

（3）冰片為復(fù)方洋金花軟膏中組成的重要部分，因其有清熱止痛功效，配伍洋金花以增加洋金花的作用，并且可提增進透皮吸收，提高藥物的生物利用度。洋金花為君藥，冰片為臣藥，二藥協(xié)同，故對冰片的含量測定是對復(fù)方洋金花軟膏質(zhì)量標準建立的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)測定10批20個樣品中的冰片的平均含量為9.67mg，為此制定復(fù)方洋金花軟膏中冰片成分的含量限度為應(yīng)不低于7.74mg·g-1，冰片性質(zhì)穩(wěn)定。

4 結(jié)論

本文建立了一種測定復(fù)方洋金花軟膏中冰片含量的GC測定法，并對所制備的10批樣品中的冰片含量進行測定，結(jié)果表明，經(jīng)方法學(xué)驗證，所建立的方法準確、可靠，可用于該復(fù)方制劑的質(zhì)量監(jiān)控，同時該方法也可用于冰片原料的質(zhì)量把控，為藥品生產(chǎn)投料提供了可靠的依據(jù)。