姚 琳，余麗麗 ，馬 薇，申婷婷 ，胡浩男

（1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，陜西 渭南 714026）

星形聚合物是一種具有高級拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的聚合物，通常采用多功能中心點(diǎn)作為“核”，以核發(fā)射出的若干線性鏈作為“臂”，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其相比線形聚合物具有顯著的優(yōu)點(diǎn)[1-3]，如封裝能力強(qiáng)、特征粘度低、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，并且可通過修飾多臂結(jié)構(gòu)賦予其多元化的功能，在醫(yī)藥、制藥和材料科學(xué)等領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用[4-6]。由于星形聚合物獨(dú)特的生物學(xué)性能和理化性質(zhì)，被廣泛的應(yīng)用于藥物輸送體系的研究[7,8]。如Shang[9]等設(shè)計(jì)合成了由兩個聚[2-（二乙氨基）甲基丙烯酸乙酯]和聚乙二醇嵌段通過二硫鍵連接的四臂星形共聚物，構(gòu)建了具有酸/氧化還原雙重響應(yīng)和主動靶向功能的多功能納米藥物載體，用于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物的高效釋放，顯示了星形聚合物在腫瘤治療中的應(yīng)用前景。

作者報(bào)道了線形聚己內(nèi)酯-聚丙烯酸羥基乙酯（LPCL-PHEA）及星形聚己內(nèi)酯-聚丙烯酸羥基乙酯（4sPCL-PHEA）兩種共聚物的合成，并以阿霉素（DOX）為模型藥物，分析探討兩種共聚物的載藥性能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克公司）；LS55熒光分光光度計(jì)（美國Perkin Elmer公司）；Nano ZS ZEN3600馬爾文激光粒度儀（英國馬爾文儀器）；FD-1000冷凍干燥機(jī)（東京理化器械株式會社）；ZF-2型三用紫外儀（上海安亭電子儀器廠）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SHA-C數(shù)顯水浴恒溫震蕩器（常州國華電器有限公司）。

ε-己內(nèi)酯（ε-CL，99%）、2-溴異丁酰溴（98%）、五甲基二乙烯基三胺（PMDETA，99%）、鹽酸阿霉素（DOX-HCl，98%）、丙烯酸羥基乙酯（HEA，98%）、辛酸亞錫[Sn(Oct)2，95%]、芘（97%）購自阿拉丁試劑有限公司；正丁醇、季戊四醇（99%）購自上海麥克林生化科技有限公司；常規(guī)試劑如二氯甲烷（DCM）、四氫呋喃（THF）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亞砜（DMSO）等均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

圖1 線形共聚物（LPCL-PHEA）（圖1a）和星形共聚物（4sPCL-PHEA）（圖1b）的合成路線Fig.1 Synthesis route of linear copolymer（LPCL-PHEA）（a）and star copolymer（4sPCL-PHEA）（b）

1.2.1 線形共聚物L(fēng)PCL-PHEA的合成

1.2.1.1 單端羥基聚己內(nèi)酯（LPCL-OH）的合成 將5.16g ε-己內(nèi)酯，0.16g 正丁醇和 4.1μL Sn（Oct）2加至50mL圓底燒瓶中減壓干燥2h，通N2，110℃反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用少量DCM溶解，冷乙醚沉降3次，將沉淀真空干燥得到LPCL-OH 4.23g。

1.2.1.2 單端溴代聚己內(nèi)酯（LPCL-Br）的合成 將1.25g LPCL-OH溶于25mL DCM，加入0.5mL三乙胺，通N2，冷卻至0℃，將0.5mL異丁酰溴溶于5mL DCM，緩慢滴加至上述混合液中，N2保護(hù)下，室溫反應(yīng)36h。反應(yīng)結(jié)束后，分別用5%NaHCO3、飽和NaCl溶液洗滌3次，無水硫酸鈉干燥，石油醚沉降3次，真空干燥得到產(chǎn)物L(fēng)PCL-Br 0.72g。

1.2.1.3 聚己內(nèi)酯-聚丙烯酸羥基乙酯（LPCLPHEA）的合成 在Schlenk瓶中依次加入0.20g LPCL-Br，4mL 1,4-二氧六環(huán)，0.03g CuBr，HEA 0.25g和42μL PMDET后冷凍-抽真空-充N2-解凍，循環(huán)3次，60℃反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至截留分子量1000的透析袋中透析24h，冷凍干燥，得產(chǎn)物L(fēng)PCL-PHEA 0.223g，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 星形共聚物（4sPCL-PHEA）的合成

1.2.2.1 星形端羥基聚己內(nèi)酯（4sPCL-OH）的合成 將4.0g ε-己內(nèi)酯，0.06g 季戊四醇和 3.2μL Sn（Oct）2加至50mL圓底燒瓶中減壓干燥2h，通N2，110℃反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后用少量DCM溶解，冷乙醚沉降3次，將沉淀真空干燥得到白色固體4sPCL-OH 3.74g。

1.2.2.2 星形溴代聚己內(nèi)酯（4sPCL-Br）的合成 將1.0g 4sPCL-OH溶于20mL DCM，加入0.34mL三乙胺（TEA），通N2冷卻至0℃，將0.25g異丁酰溴溶于3mL DCM，緩慢滴加至上述混合液中，N2保護(hù)下，室溫反應(yīng)48h。用5%NaHCO3、飽和NaCl溶液洗滌3次，無水Na2SO4干燥，石油醚沉降3次，真空干燥得產(chǎn)物4sPCL-Br 0.54g。

1.2.2.3 星形聚己內(nèi)酯-聚丙烯酸羥基乙酯（4sPCLPHEA）的合成 在Schlenk瓶中依次加入0.20g 4sPCL-Br，4mL 1,4- 二 氧 六 環(huán) ，0.03g CuBr，HEA 0.30g和42μL PMDET后冷凍-抽真空-充N2-解凍，循環(huán)3次，60℃反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用截留相對分子量1000的透析袋透析24h，冷凍干燥，得產(chǎn)物4sPCL-PHEA 0.319g，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 膠束的構(gòu)建

1.3.1 DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以混合溶劑[VDMF∶VDMSO=1∶1]配制系列濃度（0.5、1、2、4、6、8μg·mL-1）的DOX溶液，定激發(fā)波長為470nm，掃500～700nm的發(fā)射波長，測定588nm的熒光強(qiáng)度，以濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 空白膠束的制備 采用溶劑揮發(fā)法制備空白膠束：分別稱取5mg線形和星形共聚物加入5mL THF，攪拌30min后加入1mL蒸餾水，繼續(xù)攪拌2h后加入4mL蒸餾水，減壓濃縮除去THF，定容至5mL得濃度為1mg·mL-1的空白膠束。

1.3.3 透析法制備載藥膠束 采用透析法制備載藥膠束：取10mg兩種共聚物溶于750μL THF和250μL DMF 混合溶劑中，得溶液（1）；取 3mg DOX·HCl溶于250μL DMF中，再加入1D TEA得溶液（2）；將溶液（2）緩慢滴加到溶液（1）中，攪拌 30min，使聚合物結(jié)構(gòu)充分舒展，阿霉素充分分散，得溶液（3）；將溶液（3）緩慢加至5mL蒸餾水中，攪拌1h，減壓濃縮除去THF，透析（截留相對分子量 8000～14000）12h，得深紅色溶液，冷凍干燥，得載藥膠束。

1.4 膠束的性能表征

1.4.1 聚合物膠束CMC的測定 選取芘為熒光探針，采用熒光分光光度法測定CMC。稱取0.1218g芘，用乙醚定容至100mL，取1mL用乙醚定容至10mL，再取50μL用乙醚定容至5mL，得芘母液（濃度 6.02×10-6mol·L-1）。

取12個容量瓶分別加入200μL芘母液用乙醚定容至 2mL（芘濃度 6.02×10-7mol·L-1，芘在 22℃水中的飽和溶解度），待乙醚完全揮干后，加入梯度體積空白膠束用蒸餾水定容至2mL，得到系列濃度（0.5、0.25、0.1、…2.5×10-4mg·mL-1）膠束溶液，超聲10min，定激發(fā)波長為334nm，掃300～600 nm的發(fā)射波長，以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，I392/I372為縱坐標(biāo)作圖確定CMC。

1.4.2 膠束表征 取1mL空白膠束用蒸餾水定容至100mL，超聲30min，采用動態(tài)光散射粒徑測定儀（DLS）測定其粒徑及Zeta電位。

1.4.3 載藥性能測定 取0.2mg載藥膠束加入2mL混合溶劑[V(DMF)∶V(DMSO)=1∶1]溶解，采用熒光分光光度計(jì)測定DOX的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出載藥膠束的載藥量（Y1）及包封率（Y2）。

2 結(jié)果與討論

2.1 FT-IR圖譜分析

圖 2 為 LPCL-PHEA（a）和 4sPCL-PHEA（b）的紅外光譜圖。

圖 2 LPCL-PHEA（a）和 4sPCL-PHEA（b）的紅外圖譜Fig.2 FT-IR of LPCL-PHEA（a）and 4sPCL-PHEA（b）

由圖2可見，圖譜中3430cm-1有一個寬吸收帶，為-OH的特征吸收峰，2800～2900cm-1為聚己內(nèi)酯CH2上C-H的伸縮振動峰，1721cm-1為酯C=O伸縮振動吸收峰，1150～1250cm-1為CH2烷烴扭曲振動，730cm-1為CH2直鏈面內(nèi)搖擺振動，4個以上CH2成直鏈時所具有的特征峰。LPCL-PHEA圖譜中在3434cm-1可以明顯看到-OH特征峰變寬、變強(qiáng)，這是由于結(jié)構(gòu)中HEA的引入，使吸收峰變強(qiáng)，此外，在1047cm-1有一中等強(qiáng)度的吸收峰，這是一級醇C-O的伸縮振動峰。4sPCL-PHEA圖譜中在3451cm-1可以明顯看到-OH伸縮振動峰變寬、變強(qiáng)，進(jìn)一步確定了HEA基團(tuán)的成功引入。

2.2 聚合物膠束CMC值的測定

臨界膠束濃度（CMC）是研究兩親性聚合物組裝行為的一個重要參數(shù)，是鑒別膠束的形成和判斷膠束穩(wěn)定的依據(jù)。圖3分別為線形和星形聚合物的CMC測定曲線。為了加大突變趨勢，對聚合物濃度作對數(shù)處理，通過此法求兩條直線交點(diǎn)可得膠束的CMC值。

圖 3LPCL-PHEA（a）和 4sPCL-PHEA（b）的 CMC 測定Fig.3 CMC values of LPCL-PHEA（a）and 4sPCL-PHEA（b）

由圖 3可知，LPCL-PHEA的 CMC值為40.90μg·mL-1，4sPCL-PHEA的CMC值為3.589μg·mL-1，可見星形共聚物比線形具有較低的CMC值，說明在水溶液中，4sPCL-PHEA更易在低濃度下形成膠束，穩(wěn)定性更高。

2.3 DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線

DOX 的在混合溶劑[VDMF∶VDMSO=1∶1]的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 混合溶劑中DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of DOX in mixed solvents

由圖4得出DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為I=108.50533c-8.46884（c：μg·mL-1），R2=0.9995，線性良好，可以用作定量分析。

2.4 空白膠束和載藥膠束的粒徑和Zeta電位

表1為兩種共聚物膠束的粒徑和Zeta電位。

表1 空白膠束和載藥膠束的粒徑和電位Tab.1 Particle size and potential of blank micelles and drug-loaded micelles

表1結(jié)果表明，星形4sPCL-PHEA膠束的粒徑為161.1nm，線形LPCL-PHEA膠束的粒徑為172.3nm，星形共聚物膠束粒徑低于線形共聚物膠束，說明星形共聚物膠束通過中心碳鏈的連接能更好的將疏水基團(tuán)聚集在核心。從Zeta電位的結(jié)果可知，兩種膠束均具有良好的穩(wěn)定性。兩種共聚物的載藥膠束粒徑均大于空白膠束，這可能是由于DOX被包載入內(nèi)核，使粒徑增大。

2.5 聚合物對DOX的載藥性能

采用透析法制備了兩種載藥膠束LPCLPHEA@DOX和4sPCL-PHEA@DOX，根據(jù)DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及載藥量和包封率的計(jì)算公式得出：LPCL-PHEA@DOX的載藥量與包封率分別為2.75%、9.15%，4sPCL-PHEA@DOX的載藥量與包封率分別為5.43%、18.09%，結(jié)果表明星形共聚物比線形共聚物具有較高的載藥量和包封率，說明星形共聚物的特殊結(jié)構(gòu)更有利于疏水性藥物DOX在核心的富集。

3 結(jié)論

（1）本研究采用原子自由基聚合（ATRP）法分別以LPCL-Br和4sPCL-Br為引發(fā)劑，HEA為單體，PMDETA為配體，CuBr為催化劑，制備了線形與星形共聚物L(fēng)PCL-PHEA、4sPCL-PHEA，并通過FTIR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征；

（2）以芘為探針通過熒光分光光度法測定線形與星形兩種聚合物的臨界膠束濃度（CMC），結(jié)果顯示LPCL-PHEA 的 CMC 值為 40.90μg·mL-1，4sPCLPHEA的 CMC 值為 3.589μg·mL-1，可見星形共聚物比線形具有較低的CMC值；

（3）星形4sPCL-PHEA膠束的粒徑（161.1nm）低于線形LPCL-PHEA膠束的粒徑（172.3nm），Zeta電位結(jié)果表明兩種膠束均具有良好的穩(wěn)定性。

（4）以疏水性抗腫瘤藥物DOX為藥物模型研究其載藥性能，兩種共聚物均可用于DOX的包載，4sPCL-PHEA比LPCL-PHEA具有較高的載藥量和包封率，載藥量為5.43%，包封率18.09%。