劉 淼

（1.遼寧石化職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.錦州市嘉禾生物環(huán)?？萍加邢薰?，遼寧 錦州 121001）

秸稈是世界上最豐富的農(nóng)林廢棄物之一。全世界秸稈產(chǎn)量為約7.31億t，非洲2090萬(wàn)t，亞洲6.676億t，歐洲390萬(wàn)t，美國(guó)3720萬(wàn)t，大洋洲170萬(wàn)t[1]。根據(jù)BPS 2016年的數(shù)據(jù)，大米的未去殼干稻產(chǎn)量為7536萬(wàn)t，秸稈的產(chǎn)量很高，因?yàn)榇蟛糠掷w維素含量無(wú)法充分利用，利用率卻較低，秸稈只能用作飼料，有機(jī)肥料，因此,秸稈很有潛力用作生物燃料生產(chǎn)的原料[2]。

隨著石油產(chǎn)量的下降，需要其他能源來(lái)滿足未來(lái)的需求[3]?；剂蟽?chǔ)備是國(guó)家能源安全的“卡脖子”因素之一，同時(shí)石油等染料不可再生，非環(huán)境友好型燃料，會(huì)產(chǎn)生大量污染。為此，需要一種來(lái)自環(huán)境友好型生物質(zhì)的可再生能源[4]。其中之一是通過(guò)水解和酶促發(fā)酵過(guò)程從木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物燃料，例如生物乙醇，可以利用真菌產(chǎn)生葡萄糖的酶，然后將葡萄糖發(fā)酵為乙醇。

秸稈是具有高纖維素含量的廢物，可以用作生產(chǎn)纖維素酶的底物。纖維素酶是一種重要的酶，因其在各個(gè)領(lǐng)域的材料轉(zhuǎn)換和加工中都發(fā)揮著作用。在酶貿(mào)易中，有20%是纖維素酶[5]，隨著飲料，食品，洗滌劑，制漿造紙工業(yè)，乙醇，制藥和其他行業(yè)中纖維素酶的利用，酶需求有顯著增加趨勢(shì)。纖維素酶大規(guī)模使用仍然受到成本因素的限制，降低纖維素酶成本的一些策略包括：提高酶的生產(chǎn)率，以更便宜的底物生產(chǎn)酶以及以更高的活性生產(chǎn)纖維素酶[6]。由生物質(zhì)生產(chǎn)纖維素酶是降低纖維素酶價(jià)格的一種方法和增加農(nóng)業(yè)廢物的價(jià)值。從各種農(nóng)業(yè)廢料生產(chǎn)纖維素酶已被廣泛實(shí)踐，但是所得的酶活性仍然很低。纖維素酶是由多種微生物合成的，因此，微生物類型的選擇也會(huì)極大地影響酶的生產(chǎn)率[7]。

本研究的目的是研究秸稈底物對(duì)纖維素酶活性的預(yù)處理效果，以獲得水分和發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活性的最佳條件，通過(guò)確定最佳的pH值和溫度來(lái)表征粗酶的最高活性。酶促反應(yīng)的反應(yīng)，并從最高活性的粗酶中確定酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

秸稈（遼寧省某農(nóng)業(yè)基地）；真菌黑曲霉（Aspergillus niger）由種植基地泥土中篩選并分離保藏，其他相關(guān)化學(xué)試劑，如苯酚，DNS，BSA，PDA等均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 原料的制備是通過(guò)將秸稈在陽(yáng)光下干燥，然后進(jìn)行切割，粉碎和篩分，通過(guò)1mm篩子獲得最大含水量為10%的秸稈粉末。木質(zhì)纖維素含量分析參考相關(guān)文獻(xiàn)，熱重法分析灰分[8]。

1.2.2 預(yù)處理 通過(guò)添加1∶75（w/v）的秸稈粉比2.75%（V/V）NaOH溶液進(jìn)行預(yù)處理，然后將混合物通過(guò)熱板攪拌器在100℃加熱80 min。冷卻后，將混合物在濾紙和真空過(guò)濾器上使用0.2N HCl溶液中和至pH值為7。使用烘箱在70℃下將固體干燥至恒定的水含量。冷卻后，將基板存儲(chǔ)在裝有硅膠的塑料中。

1.2.3 培養(yǎng)微生物 黑曲霉在馬鈴薯瓊脂（PDA）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。真菌在無(wú)菌條件下（30±2）℃的溫度下孵育。

1.2.4 接種 通過(guò)將黑曲霉的純培養(yǎng)物添加到培養(yǎng)基溶液獲得接種物。接種液的培養(yǎng)基用10g·L-1葡萄糖溶液50mL，然后加入5mL葡萄糖溶液。根據(jù)Mendels配方提供的營(yíng)養(yǎng)：（NH4）2SO41.4g；KH2PO42.0g； 尿 素 0.3g；MgSO4·7H2O 0.3g；ZnSO4·7H2O 0.0014g；FeSO4·7H2O 0.005g；MnSO40.0016g；CoCl20.002g；CaCl20.002g；吐溫80 2.0ml加入1L去離子水中。調(diào)節(jié)pH值3.5并滅菌。冷卻后，加入微生物，并將接種物在30℃下?lián)u瓶。

1.2.5 纖維素酶的生產(chǎn) 纖維素酶的生產(chǎn)是通過(guò)將樣品放入錐形燒瓶中，然后將營(yíng)養(yǎng)液和水添加到含水量60%，65%，70%，75%和80%，然后將pH值設(shè)置為3.5，滅菌。冷卻后，加入孵育接種物。隨后，將混合物在（30±2）℃下以 3、4、5、6 d 的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，補(bǔ)充O2。

1.2.6 酶提取 通過(guò)使用漏斗和濾紙?jiān)?50mL的燒杯上以底物與水的比例為1∶50（w/v）提取發(fā)酵產(chǎn)物。使用培養(yǎng)箱搖床以200r·min-1在30℃下?lián)u動(dòng)濾液1h。在6000r·min-1離心15min后獲得上清液，進(jìn)行分析。

1.2.7 纖維素酶活性測(cè)定 酶的活性是通過(guò)在1mL粗麥芽中插入粗酶的初始處理來(lái)確定的。加入1%CMC（w/v）和0.1 M檸檬酸鈉溶液（pH值 4.8）的緩沖液。將混合物在40℃下孵育30min。還原糖通過(guò)DNS方法（3，5-二硝基水楊酸）測(cè)定。酶活性的一個(gè)單位（U）是在分析條件下每分鐘產(chǎn)生1.0μmol葡萄糖所需的酶量。

為了通過(guò)在40、50、60和70℃下進(jìn)行的具有最高酶活性的粗酶的酶活性測(cè)試中改變底物濃度（S）來(lái)確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。不同的底物濃度導(dǎo)致不同的酶活性（V0）。根據(jù)Michaelis-Menten方程獲得每個(gè)溫度的 1/Km和 1/Vmax。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理對(duì)纖維素酶活性的影響

預(yù)處理或去木質(zhì)素化是改變木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以降低木質(zhì)素選擇性，從而分解化學(xué)鍵和其他成分的過(guò)程[9]。纖維素和半纖維素是秸稈中的碳水化合物，可以通過(guò)酶促水解為葡萄糖。因?yàn)椴牧现心举|(zhì)素的存在會(huì)抑制酶水解和微生物發(fā)酵期間的纖維素消化，所以需要對(duì)原材料進(jìn)行預(yù)處理。表1列出了原材料表征的結(jié)果。

表1 原料分析結(jié)果Tab.1 Result of raw material analysis

從表1中可以看出，預(yù)處理引起的纖維素含量增加了70.25%，半纖維素含量增加了35.14%，木質(zhì)素含量減少了37.2%。這是因?yàn)閴A性預(yù)處理可以除去木質(zhì)素而不影響其他組分。使用NaOH進(jìn)行預(yù)處理會(huì)導(dǎo)致材料中的亞麻酸減少，表面積增加，孔徑增加以及木質(zhì)素與纖維素和半纖維素之間的鍵斷裂，從而降低了結(jié)晶度[10]。堿預(yù)處理期間纖維素的增加主要是由于木質(zhì)素的減少。木質(zhì)素隨著其溶解而堿性溶液減少。

從表1也可以看出，蛋白質(zhì)含量下降了3倍。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在45°C時(shí)開(kāi)始變性。蛋白質(zhì)是具有C，H，O，N元素作為產(chǎn)生酶的營(yíng)養(yǎng)素的氨基酸。碳充當(dāng)酶的輔助因子，而發(fā)酵過(guò)程中則需要氮，其影響黑曲霉的活性?；曳莶粫?huì)改變，因?yàn)镹aOH只除去木質(zhì)素而沒(méi)有去除其他成分[11]。因此，與相關(guān)學(xué)者研究結(jié)果相比[18]在不同底物，真菌和方法進(jìn)行預(yù)處理的情況下，生產(chǎn)纖維素酶的方法與使用pH值為4的本研究略有不同，最高纖維素酶活性提高了21.40%。在本研究中，纖維素酶的最高活性為水分含量為75%和發(fā)酵4d時(shí)的3.12U·mL-1，見(jiàn)圖1。

圖1 預(yù)處理和未預(yù)處理的纖維素酶活性Fig.1 Cellulase enzyme activity with pretreatment and without pretreatment

2.2 含水量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活性的影響

2.2.1 水分含量對(duì)纖維素酶活性的影響 水分含量影響微生物的生長(zhǎng)，生物合成和酶分泌，因此，水分是固態(tài)發(fā)酵的重要因素之一。水含量對(duì)纖維素酶活性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 水分含量對(duì)纖維素酶活性的影響Fig.2 Effect of water content on cellulase enzyme activity

酶活性將隨著水含量的增加而增加，在發(fā)酵時(shí)間為4d的情況下，當(dāng)水含量為75%時(shí)，最佳酶活性為3.12U·mL-1。但是，酶活性在含水量為80%時(shí)下降。對(duì)于發(fā)酵時(shí)間的所有變化，不同含水量固態(tài)發(fā)酵秸稈進(jìn)行考察。水分含量低，導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)緩慢，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)育和可及性較低。雖然水含量很高，但會(huì)導(dǎo)致基材孔隙率降低，因此，減少了氧對(duì)顆粒的滲透[12]。

從圖2可以看出，在含水量為75%的秸稈可獲得了最高的纖維素酶活性。黑曲霉在含水量為70%～80%時(shí)可以很好地生長(zhǎng)。物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量的存在表明材料中酶的存在。由于真菌體由含氮元素組成，因此，隨著霉菌（真菌）的生長(zhǎng)而增加了蛋白質(zhì)含量。真菌產(chǎn)生的酶也是一種蛋白質(zhì)。真菌的細(xì)胞壁含有6.3%的蛋白質(zhì)，而帶有菌絲的真菌細(xì)胞膜含有25%～45%的蛋白質(zhì)和25%～30%的碳水化合物。在其生長(zhǎng)過(guò)程中，真菌使用碳和氮作為真菌的體細(xì)胞成分。發(fā)生此過(guò)程的原因是，在黑曲霉的發(fā)酵過(guò)程中，使用了營(yíng)養(yǎng)素（尤其是碳水化合物）來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)并增加了蛋白質(zhì)含量[13]。

發(fā)酵4d時(shí)，在75%的水含量時(shí)獲得最高的蛋白質(zhì)含量為0.34mg·mL-1，而在60%水分和3d的發(fā)酵時(shí)間時(shí)獲得的最低蛋白質(zhì)含量為0.22mg·mL-1。在含有復(fù)雜分子的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的黑曲霉可以分泌細(xì)胞外酶，例如α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶，蛋白酶和纖維素酶[14]。因?yàn)榇置笧V液中的大多數(shù)蛋白質(zhì)由纖維素酶組成。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活性的影響 發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖維素酶活性的影響Fig.3 Effect of fermentation time on cellulase enzyme activity

從圖3中可以看出，對(duì)于所有水分含量的變化，酶活性隨發(fā)酵時(shí)間增加而提高。在第四天發(fā)酵時(shí)都獲得了最高的纖維素酶活性。但是，酶活性在第五天和第六天下降。在發(fā)酵初期，酶的活性仍然很低。酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的增加而提高，而當(dāng)可用營(yíng)養(yǎng)素耗盡時(shí)則降低。形成孢子的生物通常在指數(shù)后階段產(chǎn)生酶。

當(dāng)產(chǎn)生的酶活性高時(shí)，霉菌就處于該階段。由于培養(yǎng)基特性，微生物類型，養(yǎng)分濃度和所用過(guò)程的生理?xiàng)l件的差異，纖維素酶生產(chǎn)的各種最佳發(fā)酵期[15]。

2.3 pH值和溫度對(duì)纖維素酶活性的影響

為了發(fā)揮pH值對(duì)酶活性的影響，具有離子基團(tuán)酶的活性位點(diǎn)需處于最適pH值（酸或堿）。pH值的介質(zhì)變化導(dǎo)致活性位點(diǎn)的離子形成和酶活性的改變，從而影響反應(yīng)速率。pH值的變化也可以改變酶活性的大小?；蛘邠Q言之，酶具有活性位點(diǎn)，其中某些基團(tuán)在底物（ES）復(fù)合物的形成中充當(dāng)催化劑。pH值的變化會(huì)影響官能團(tuán)的電離，從而導(dǎo)致酶構(gòu)象及其催化性能發(fā)生變化。因此，該酶僅在一定的pH值范圍內(nèi)才有活性。最大反應(yīng)速率，Km和酶的穩(wěn)定性受培養(yǎng)基pH值的影響。

當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，pH值對(duì)纖維素酶活性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)纖維素酶活性的影響Fig.4 Effect of pH on cellulase enzyme activity

從圖4中可以看出，在pH值為2時(shí)纖維素酶的活性很低，在pH值為3和4時(shí)有所增加。在pH值為4時(shí)，纖維素酶活性最高，為3.28U·mL-1；之后開(kāi)始下降，pH值為8時(shí)，其活性降低，下降幅度高達(dá)55.45%。相關(guān)研究結(jié)果同樣得出了相似結(jié)論：在pH值為3～6.5下，纖維素酶的活性最佳。

溫度是影響酶活性發(fā)展的環(huán)境因素之一。酶-催化劑反應(yīng)的速率隨著溫度的升高而有所提高。溫度升高將使反應(yīng)速率僅增加到一定范圍。反應(yīng)速率隨著溫度的升高而增加，并且反應(yīng)速率的提高是由反應(yīng)分子動(dòng)能的增加引起的。然而，更高的能量增加將破壞保留酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的弱氫鍵和疏水鍵。另外，高溫也可能影響底物構(gòu)象，因此，對(duì)進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)具有抵抗力。在pH值為4時(shí)，各底物濃度下，溫度對(duì)酶活性之間的影響見(jiàn)圖5。

圖5 底物濃度對(duì)纖維素酶活性的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on cellulase enzyme activity

從各個(gè)底物濃度的4個(gè)變化中出現(xiàn)的現(xiàn)象是相同的：首先是酶活性較低，隨著溫度的升高，酶活性也在增加；然后在60℃后酶活性開(kāi)始降低；最高的酶活性出現(xiàn)在60℃，羧甲基纖維素酶（CMC）濃度為5.05U·mL-1時(shí)，底物濃度為1.25%。

纖維素酶是一種嗜熱酶，具有50～65℃的最大活性。較高的溫度可能會(huì)增加產(chǎn)物的形成，因此，纖維素酶在工業(yè)中具有潛在應(yīng)用前景[16]。

2.4 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

確定最大反應(yīng)速率（Vmax）和米氏（Michaelis-Menten）常數(shù)（Km）是了解該酶特性的重要步驟。Vmax值表示酶在底物上的飽和度，而Km表示酶的催化效率，定義為酶的催化速度達(dá)到最大速率的一半時(shí)的底物濃度[17]。用作親和力測(cè)量值ES的Km值還與ES復(fù)合物的脫硫平衡平衡常數(shù)變?yōu)镋和S有關(guān)。如果Km值較小，則加和表示ES復(fù)合物穩(wěn)定且對(duì)底物的酶親和力高，如果酶的Km值大，則變低。Km值隨基材類型，環(huán)境狀態(tài)和離子強(qiáng)度的不同而有很大差異。

基于Michaelis-Menten方程，底物濃度和纖維素酶之間的關(guān)系。圖5顯示了在40、50、60、70℃溫度下的活性。

根據(jù)動(dòng)力學(xué)理論，底物濃度越高，分子之間碰撞的能量和頻率越高，因此，更多的纖維素酶可以與纖維素結(jié)合形成糖基酶復(fù)合物，從而進(jìn)一步形成葡萄糖產(chǎn)物。如圖5所示，隨著底物濃度的增加，酶的活性也增加。然而，底物濃度增加至一定濃度后，酶活性的增加將停止。Vmax和Km值可以通過(guò)將Michaelis-Menten方程轉(zhuǎn)換為L(zhǎng)ineweaver-Burk方程，每個(gè)溫度變化的Vmax和Km值見(jiàn)表2。

表2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)Tab.2 Parametic of kinetic reaction enzimatic

從表2看出，Vmax和Km在每個(gè)溫度的差異是由于酶催化劑具有不同的反應(yīng)溫度導(dǎo)致不同的反應(yīng)率。外部溫度的增加通常會(huì)增加酶的化學(xué)反應(yīng)速率，但過(guò)高的溫度上升會(huì)使酶變性。過(guò)多的熱能可以增加酶的動(dòng)力學(xué),可以超過(guò)所需的能量極限破壞共價(jià)鍵構(gòu)成酶的結(jié)構(gòu)。由于多肽鏈變得展開(kāi)或變性，降低催化活性。

3 結(jié)論

利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵方法從秸稈中生產(chǎn)纖維素酶。通過(guò)在使用的底物上進(jìn)行預(yù)處理，可以增加纖維素酶的酶活性為21.40%。在水含量為75%且發(fā)酵時(shí)間4d的情況下，最高酶活性為3.12U·mL-1。從產(chǎn)生的纖維素酶和最高的活性出發(fā)，研究了pH值和溫度對(duì)酶活性的影響。在pH值為4和溫度60℃時(shí)，酶活性最高，為5.05U·mL-1。從酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)所獲得的60℃溫度下的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Vmax為5.82U·mL-1；Km為 0.32mmol·L-1。