楊 陽 ，嚴 敏 ，朱美旗 ，高文運

（1.西安醫(yī)學院藥學院 藥物研究所，陜西 西安710021;2.西北大學 國家微檢測系統(tǒng)工程研究中心 生命科學學院，陜西 西安710069）

晚期糖基化終產(chǎn)物 (advanced glycation end products，AGEs）是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應（又稱Maillard反應），所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱，其結(jié)構(gòu)具有高度異質(zhì)性。

現(xiàn)今研究已證明AGEs是糖尿病并發(fā)癥如糖尿病腎病、糖尿病血管神經(jīng)性病變的重要的機制之一[1-3]。同時，還有研究表明AGEs可以和人體的各種組織細胞相結(jié)合并且破壞這些組織細胞，加速人體的衰老，從而引起各種慢性退化性的疾病，比如阿爾茨海默病，動脈粥樣硬化等疾病[4-6]。

α-二羰基化合物（ɑ-dicarbonyl compounds，ɑ-DC），是Maillard反應的重要中間產(chǎn)物，也是美拉德反應產(chǎn)生的有害物質(zhì)即丙烯酰胺，4（5）-羥甲基糠醛，雜環(huán)胺等的重要前體物質(zhì)。是在體內(nèi)和體外都能產(chǎn)生的化學和生物活性物質(zhì)?；谑称返馁|(zhì)量控制以及保護人類健康，建立有效實用的檢測手段來量化各種食品和生物樣品中的α-DCs具有重要意義。

由于α-DCs是一類有著高度水溶而且缺乏發(fā)色團的化合物，通過對它們進行衍生化來引入一些具有紫外吸收的基團，從而來提高它們的可檢測性是目前的主要檢測方法之一。通常使用的衍生化試劑是鄰苯二胺類化合物，原理是鄰苯二胺類化合物可以通過其鄰二氨基與α-DCs形成喹喔啉化合物[7]，進而產(chǎn)生紫外吸收。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)使用4-硝基鄰苯二胺（NPDA）作為衍生化試劑的文獻報道少，且各文獻報道用NPDA柱前衍生測定α-DCs含量的衍生條件不一致[8-10]，并且不同衍生條件對測定結(jié)果的影響未見報道。故本研究對HPLC法檢測AGEs前體物質(zhì)（乙二醛、甲基乙二醛、2，3-丁二酮、2，3-戊二酮）的柱前衍生化條件進行優(yōu)化，可為后續(xù)食品或生物樣品中α-DCs的測定打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SQP電子分析天平（賽多利斯科技儀器（北京）有限公司）；DG-800旋渦混合器（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司鞏義市予華儀器有限責任公司）；BDWI-HH-2A電熱恒溫水浴鍋（北京中西遠大科技有限公司）；8453（紫外-可見分光光度計美國Agilent公司）；Agilent LC1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

1.2 試劑

甲醇（色譜純霍尼韋爾貿(mào)易上海有限公司）；4-硝基-1，2-苯二胺（NPDA阿拉丁上海精純試劑有限公司）；乙二醛水溶液（8.8M阿拉丁上海精純試劑有限公司）；甲基乙二醛（32%溶液阿拉丁上海精純試劑有限公司）；2，3-丁二酮（99%阿法愛莎醫(yī)藥有限公司）；2，3-戊二酮（97%西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；濃鹽酸（AR上海生物工程技術(shù)有限公司）；氫氧化鈉（AR四川西隴化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 α-二羰基類化合物的衍生化反應

將50mM的2，3-戊二酮、甲基乙二醛、2，3-丁二酮、乙二醛水溶液用超純水分別逐級稀釋至濃度為500μM，將10mM的NPDA醇溶液用甲醇逐級稀釋至濃度為500μM，然后將α-DCs標準品溶液各取100μL與100μL NPDA分別渦旋混勻，再加入800μL的甲醇稀釋至α-DCs標準品溶液終濃度為50μM，用pH值為1～14的B-廣泛試紙調(diào)pH值至3，用電熱恒溫水浴鍋在適宜的溫度下加熱一定的時間，取出放置至室溫，4℃保存待檢。

2.2 紫外最大吸收波長的確定

因α-DCs無紫外吸收，因此，需檢測衍生化反應前后紫外吸收波長的變化，所以首先單獨取500μM NPDA 200μL 裝入石英比色皿中，在 200～800nm波長范圍掃描，測得有兩個最大的吸收波長，分別是λ1=272.0nm，λ2=401.0nm。然后分別取衍生化后的α-DCs標準品溶液200μL置于石英比色皿中，在200～800nm波長范圍掃描，結(jié)果見表1。

表1 α二羰基類化合物衍生化產(chǎn)物紫外-可見吸收波長Tab.1 Ultraviolet-visible absorption wavelength of derivatives of dicarbonyl compounds

由表1可見，測得的結(jié)果基本接近于260.0nm，且260.0nm處的峰容易辨別，故采用260.0nm作為最大吸收波長。

2.3 色譜條件的選擇和色譜峰的檢測

色譜柱Shim Pack VP-ODS C18column（250×4.6mm，5μm）；流動相甲醇∶水 =65∶35，等度洗脫；流速 0.7mL·min-1；柱溫 35℃；進樣量 10μL；檢測波長260nm。4種α-DCs的色譜峰見圖1。

圖1 柱前衍生化后4種α二羰基類化合物的液相色譜圖Fig.1 Pre-column derivatization HPLC chromatogram of 4 α-dicarbonyl compounds 1.NPDA 2.methylglyoxal 3.glyoxal 4.2,3-butanedione 5.2,3-pentanedione

2.4 單因素試驗-衍生化反應條件的優(yōu)化

2.4.1 pH值對衍生化反應進程的影響 取1mM的NPDA，200μM的 2，3- 戊二酮各 200μL，以物質(zhì)的量比例為5∶1（終濃度為100μM）平行配制12份樣品，分為4組，每組設(shè)3個平行。4組的pH值分別調(diào)至3、5、7、9，在同一溫度下加熱一定時間，過 0.22μm濾膜，按2.3方法測定峰面積。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮相同。結(jié)果見圖2。

圖2 pH值對α二羰基類化合物衍生化反應的影響Fig.2 Effect of pH on the derivatization of α-dicarbonyl compounds

由圖2可見，甲基乙二醛和戊二酮在pH值為3時的峰面積最大，為反應最適pH值條件。丁二酮在pH值為5時的峰面積略大于其余3個pH值條件下的峰面積，衍生化反應受pH值為值影響較小。乙二醛的峰面積則在pH值為9時最大。本實驗結(jié)果說明，除乙二醛外，其余3個α-DCs的最適反應條件為酸性，而乙二醛的衍生化反應則隨著pH值的升高而增強，最適反應條件為堿性。

2.4.2 溫度對衍生化反應進程的影響 取1mM的NPDA，200μM的 2，3- 戊二酮各 200μL，以物質(zhì)的量比例為5∶1(終濃度為100μM)平行配制12份樣品，分為4組，每組設(shè)3個平行。將樣品的pH值均調(diào)至 3，4 組樣品分別在溫度為 25、40、60、80℃時加熱一定時間，過0.22μm濾膜，按2.3方法測定峰面積。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮相同。結(jié)果見圖3。

由圖3可見，2，3-丁二酮和戊二酮的衍生化反應對溫度不敏感，40℃為最適反應溫度。乙二醛在40℃時反應產(chǎn)物的峰面積最大，之后隨著溫度升高，峰面積下降，初步判斷是由于溫度過高而產(chǎn)物發(fā)生了分解所致。因此，乙二醛衍生化的最適反應溫度也為40℃。而甲基乙二醛的最適反應溫度為60℃。

圖3 溫度對α二羰基類化合物衍生化反應的影響Fig.3 Effect of temperature on derivatization of α-dicarbonyl compounds

2.4.3 加熱時間對衍生化反應進程的影響 取1mM的 NPDA，200μM的 2，3- 戊二酮各 200μL，以物質(zhì)的量比例為5∶1（終濃度為100μM）平行配制15份樣品，分為5組，每組設(shè)3個平行。將樣品的pH值均調(diào)至 3，5 組樣品分別于 40℃加熱 10、20、30、60、120min，過0.22μm濾膜，按2.3方法測定峰面積。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮相同。結(jié)果見圖4。

圖4 加熱時間對α二羰基類化合物衍生化反應的影響Fig.4 Effect of heating time on the derivatization of α-dicarbonylcompounds

由圖4可見，丁二酮和乙二醛的峰面積隨加熱時間變化的趨勢一致，最適反應溫度均為30℃。戊二酮與甲基乙二醛的最適反應溫度均為20℃。戊二酮的色譜圖中，當加熱時間達到或超過60min，在TR=10min附近出現(xiàn)雜峰，說明高溫會導致反應產(chǎn)物分解或發(fā)生其他副反應。

2.4.4 物質(zhì)的量的比例對衍生化反應進程的影響 分別按照體積比 1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、10∶1 的比例取200μM的NPDA和200μM的2，3-戊二酮，混勻。每個比例平行配置3份，共15份。調(diào)pH值至3，在40℃下加熱20min，過0.22μm濾膜。按2.3方法測定峰面積。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮相同。結(jié)果見圖5。

圖5 物質(zhì)的量的比例對α二羰基類化合物衍生化反應的影響Fig.5 Effect of the ratio of the amount of substance on the derivatization of α-dicarbonyl compounds

由圖5可見，戊二酮和2，3-丁二酮在物質(zhì)的量1∶1時，峰面積最大，此后隨著NPDA量的增加，峰面積逐漸下降。說明二者最適的反應物質(zhì)的量比例為1∶1。甲基乙二醛和乙二醛最適的反應物質(zhì)的量比例分別為 8∶1 和 10∶1。

2.5 優(yōu)化后標準曲線的制備

用甲醇和超純水分別將NPDA和2，3-戊二酮儲備液稀釋為 2、1、0.5、0.25、0.125mM的溶液，各吸取相同濃度的二者200μL，混勻。制成2，3-戊二酮終濃度分別為 1000、500、250、125、62.5μM 的系列濃度溶液。調(diào)pH值至3，在40℃下加熱20min，按2.3方法測定。以2，3-戊二酮衍生物的峰面積A對2，3-戊二酮摩爾濃度C進行線性回歸，繪制標準曲線。甲基乙二醛、丁二酮、乙二醛配制方法與戊二酮類似。各化合物的標準曲線如下：2，3-戊二酮y=4.7749x+74.017，R2=0.9993，在 62.5～1000μM 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；甲基乙二醛y=82.987x-542.14，R2=0.9995，在 5.5～220μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；2，3-丁二酮y=9.1958x+58.938，R2=0.9981，在 5～1000μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；乙二醛y=10.967x-75.27，R2=0.9979，在5～120μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 衍生化反應產(chǎn)物的穩(wěn)定性試驗

精密吸取濃度為 500μM的 NPDA 400μL，500μM的 2，3- 戊二酮 400μL（物質(zhì)的量的比例 1∶1）置于同一4.0mL的EP管中，用旋渦混合器混勻，調(diào)pH值至3，在40℃下加熱20min，其余化合物均在最適反應條件下配置和反應。在2.3的色譜條件下，分別測產(chǎn)物 0，12，24，48h 內(nèi)的峰面積，2，3- 戊二酮，甲基乙二醛，2，3-丁二酮，乙二醛衍生物峰面積的RSD值分別為4.82%，2.12%，4.88%，2.08%，結(jié)果表明衍生化后供試溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

鄰苯二胺（o-Phenylenediamine，OPDA）及其類似物能夠與α-DCs反應形成喹喔啉衍生物，從而使原本缺乏紫外吸收的α-DCs產(chǎn)生較強的紫外吸收，可用作柱前衍生-HPLC方法測定α-DCs的衍生化試劑。其中NPDA苯環(huán)上的硝基令它比一些簡單的鄰苯二胺類化合物，如OPDA在紫外及可見光波段的吸收都更強。且該試劑穩(wěn)定性好、價格低廉，易于獲得。而各文獻報道用NPDA柱前衍生測定α-DCs含量的衍生條件不一致，并且不同衍生條件對測定結(jié)果的影響未見報道。因此，本實驗單因素考察pH值，反應溫度，反應時間，物質(zhì)的量比例對α-DCs衍生化反應的影響，結(jié)果表明，本文中4個α-DCs的衍生化反應條件除乙二醛外均為酸性，在實驗中發(fā)現(xiàn)，乙二醛在酸性條件下的反應需提高溫度到70～80℃，與文獻報道一致，但長時間加熱會影響α-DCs前體物質(zhì)的自氧化，且在衍生化試劑的存在下會改變葡萄糖的自氧化途徑，這些都會導致α-DCs的含量測定并不準確。而在堿性條件下乙二醛的反應溫度溫和。另外，在四個α-DCs中，甲基乙二醛對于反應條件的變化最為敏感。

4 結(jié)論

綜上，本實驗結(jié)果說明，NPDA可在溫和的反應條件下，短時間內(nèi)與α-DCs發(fā)生衍生化反應。甲基乙二醛，2，3-丁二酮，2，3-戊二酮的反應最適pH值為酸性，乙二醛的最適pH值為堿性。加熱溫度不宜過高，加熱時間不宜過長，否則衍生化產(chǎn)物可能會發(fā)生分解。可為后續(xù)食品或生物樣品中α-DCs的測定打下基礎(chǔ)。