201199復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院急診科，上海

對患者實施心肺復(fù)蘇(CRP)后，會引發(fā)不同程度腦損傷，具有較高致殘率和死亡率。其中主要原因是由于產(chǎn)生再灌注性損傷，無有效治療手段。據(jù)相關(guān)資料表明[1]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在缺血再灌注損傷中占據(jù)重要作用，缺血預(yù)處理可讓患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激得到抑制，使非正常折疊蛋白數(shù)量減少，進(jìn)而減緩腦缺血再灌注，因此為了能夠探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和CRP 后腦損傷之間關(guān)系，本文以實驗大鼠為實驗活體，擬建立大鼠心臟驟停以及CRP模型，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和CRP 后腦損傷之間關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

選取某科研院所提供的體重為300～400 g的健康雄性大鼠，大鼠在實驗前及CRP后，按照時間進(jìn)行分組，分別在1 h、3 h、6 h、12 h 及24 h 等時間點進(jìn)行分組，5 只/組。大鼠生命體征良好，經(jīng)測試無重大疾病。在實驗前1 天禁食，可飲水。

方法：準(zhǔn)備實驗器材以及藥劑，全套小型動物維持系統(tǒng)設(shè)備，包含小動物呼吸機(jī)、探針式溫度計及氣管插管、注射器等。實驗藥劑包主要有戊巴比妥鈉、肝素、腎上腺素等以及各種測定試劑盒，可以對小動物各種生命指標(biāo)進(jìn)行檢查。①麻醉及術(shù)前準(zhǔn)備工作：給所有大鼠進(jìn)行編號分組，并進(jìn)行稱量后確定戊巴比妥鈉注射量，按照45 mg/kg 進(jìn)行麻醉注射，如有中途醒來的應(yīng)追加戊巴比妥鈉10 mg/kg 進(jìn)行麻醉，并將大鼠麻醉后，固定于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒器具、鋪巾等，在實驗過程中，利用加熱燈保持大鼠體溫。②氣管插管：麻醉后，使大鼠保持仰臥位并進(jìn)行固定，露出頸部，逐層分離各項組織，使氣管暴露，將大鼠舌頭拉向一側(cè)，并將氣管插管插入氣管中，會感受到齒輪型阻力，深度5 cm 左右。術(shù)中大鼠會有嘔吐反射，成功后可吸去腔內(nèi)黏液，避免對氣管阻塞。③心臟驟停的模型建立：為讓大鼠心臟發(fā)生驟停，本次研究采取經(jīng)皮電刺激方誘發(fā)。麻醉完成后，暴露前胸，在胸骨左緣第4及右緣第3肋骨處插入無菌針灸針，當(dāng)發(fā)現(xiàn)針灸隨心臟跳動后，則已經(jīng)進(jìn)入心外膜，再進(jìn)針深度1 cm，完成后需要和電刺激器相連。設(shè)置參數(shù)后，誘導(dǎo)大鼠心臟驟停，并持續(xù)刺激3 min避免出現(xiàn)復(fù)跳。通過生命監(jiān)測系統(tǒng)對大鼠血壓進(jìn)行監(jiān)測，血壓20 mmHg，則需停止刺激。當(dāng)動脈波形消失及進(jìn)行計算無干預(yù)6 min 后，開展CRP。④CRP：大鼠心臟驟停6 min后開展CRP，應(yīng)立即采用呼吸機(jī)輔助通氣，氧氣濃度保持100%，頻率80 次/min，氣量0.65 mL/100 g，并進(jìn)行腎上腺素推注(20 μg/kg)并用示指及中指在胸骨下進(jìn)行按壓，3～4次/s，直至自主循環(huán)恢復(fù)，大鼠竇性心律，且動脈壓保持在60 mmHg長達(dá)10 min，如達(dá)不到10 min 則復(fù)蘇失敗，放棄搶救。⑤CRP 后處理：復(fù)蘇成功后，將氧氣濃度調(diào)整為正常值，根據(jù)大鼠實際情況，停止機(jī)械通氣，并在2 h后需要拔出靜脈直管以及氣管插管，將大鼠放入籠子，進(jìn)行觀察，正常后開展后續(xù)實驗。

觀察指標(biāo)：對各組大鼠進(jìn)行腦組織海馬RNA 的提取，并對大鼠腦組織海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)記物的含量進(jìn)行測定，采用Real time PCR 的方法對海馬組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)記物含量進(jìn)行檢測。腦組織海馬蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物表達(dá)采用Western blot 的方法測定海馬蛋白內(nèi)GRP 78、XBP-1、CHOP 和caspase 12蛋白表達(dá)量。

表1 各組大鼠于CPR后1h、24h與sham組海馬ERS標(biāo)記物mRNA含量比較(μg)

表2 各組大鼠于CPR后1h、24h與sham組海馬ERS標(biāo)記物蛋白含量比較(μg/L)

觀察指標(biāo)：數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 軟件處理；所有計量數(shù)據(jù)以Mean±SEM 表示，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用Student-Newman-Keuls 檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

各組實施CRP 后海馬ERS 標(biāo)記物以及mRNA 含量比較：GRP 78、XBP-1 信使RNA含量在CRP后持續(xù)增加，GRP 78在24 h后達(dá)到峰值，含量是sham組(本次研究中sham組是假手術(shù)組，目的在于作為對照，從而進(jìn)一步說明研究結(jié)果的科學(xué)性。)的2倍，XBP-1信使RNA是sham的1.67 倍，CHOP 和caspase 12 信使RNA則增加量和GRP 78、XBP-1 相比較為緩慢。而CPR 后24 h，CHOP 和caspase 12分別增加1.91 倍和1.62 倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

各組實施CRP 后海馬ERS 標(biāo)記物蛋白質(zhì)比較：在GAPSH 表達(dá)一致的情況下，在和sham 組比較后，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12 均 為 增 加量，其中CRP 進(jìn)行3 h 后，GRP78、XBP-1 增加較為明顯，CHOP、caspase 12則在6 h，sham組相比，在CRP后24 h，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12分別增加1.58 倍、1.76 倍、2.13 倍、2.51 倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

討 論

在CRP 完成后導(dǎo)致腦損傷的生理功能十分復(fù)雜，過量氧自由基及氨基酸毒性損傷，病理性蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)凋亡信號激活，是導(dǎo)致腦部損傷的主要原因。因此全身系統(tǒng)綜合管理具有非常重要的作用和意義，但目前雖然新藥層出不窮，但療效顯著的治療方式仍屈指可數(shù)[2-3]。所以需要采取新的研究方向，找到新的信號通路以及藥物對CPR進(jìn)行改善，并對神經(jīng)功能障礙方面進(jìn)行的腦復(fù)蘇領(lǐng)域作為重點研究項目。人們已經(jīng)逐步發(fā)現(xiàn)，ERS 反應(yīng)和相關(guān)信號的傳導(dǎo)機(jī)制與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制，且ERS 厚內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會出現(xiàn)大量沒有折疊的蛋白，隨時間持續(xù)，未折疊蛋白會大量聚集，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受到影響，細(xì)胞凋亡。大量沒有折疊的蛋白質(zhì)會引發(fā)各種系統(tǒng)功能障礙[4-5]。在本次研究中，在CRP 后24 h，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12 分 別 增 加1.58倍、1.76倍、2.13倍、2.51倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，和周東民等[6]人研究結(jié)果一致。

綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和CRP 后腦損傷之間關(guān)系密切，但需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。