周茂生，胡旭峰，謝加兵，吳興凈，張 欣

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241001)

骨質疏松癥是一種以骨密度和骨量減少為特征的疾病，在美國、歐洲和日本危害7500萬人，每年全世界超過890萬人出現(xiàn)骨質疏松性骨折[1]。一旦發(fā)生骨折或缺損時超過一定體積，就需要骨移植手術進行骨修復。自體骨移植是目前廣泛接受的治療骨折和骨缺損最常用方法之一[2]。由于自體骨移植供區(qū)有限，同種異體骨移植可能出現(xiàn)排斥反應，因此人工合成材料備受關注[3]。磷酸鈣(calcium phosphate,CPC)具有良好的生物相容性、生物降解性和骨傳導性，是目前應用最廣泛的骨再生材料之一[3-5]。先前的研究表明，CPC中鍶(Sr)的存在可促進生物材料的吸收性和隨后的骨形成[6]；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)由于其優(yōu)異的骨誘導能力而被廣泛用于促進骨修復；BMP-2可以通過收集骨祖細胞并誘導成骨分化來促進骨修復[7]。由于臨床使用中BMP-2局部劑量較高，會出現(xiàn)一些不良反應，如異位骨化與椎管狹窄導致脊髓壓迫等[8]。本研究將BMP-2復合Sr修飾CPC對比研究同等劑量BMP-2復合CPC修復骨質疏松骨缺損治療效果，驗證新復合材料治療骨質疏松骨缺損的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 50只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠納入本研究，在環(huán)境溫度(22±1)℃和相對濕度(45±50)%的條件下隨意飼養(yǎng)，水和食物可以自由接觸。自動控制明暗周期約12 h。所有程序均經我院動物倫理委員會批準。

1.2 材料制備 CPC和Sr/CPC的制備使用等摩爾TTCP[Ca4(PO4)2O]和DCPA(CaHPO4)制備CPC前體粉末。隨后按照1 mg粉末加入0.2 mg BMP-2，固化劑為 0.5 mol/L 稀磷酸，在室溫、100% 相對濕度條件下分別固化 24 h，制成直徑2.5 mm、高度5 mm樣品(固化時粉、液質量比為2∶1)。分別為CPC、BMP-2/Sr/CPC(每1 mg材料中含有0.2 mg BMP-2)和BMP-2/CPC(每1 mg材料中含有0.2 mg BMP-2)，具體材料制備步驟參考文獻[9]。

1.3 模型建立 雙側去卵巢手術后12周，將大鼠隨機分為： 假手術組(Sham，n=5)和卵巢切除模型組(OVX，n=45)。模型建立12周后，OVX大鼠隨機分為對照組(Con組) 、CPC組(CPC組)、BMP-2/CPC組(BCPC組)和BMP-2/Sr/CPC組(BSCPC組),隨后在大鼠股骨髁制作直徑2.5 mm、長5 mm圓形缺損。通過腹膜內注射4 mL/kg水合氯醛麻醉大鼠。在雙側股骨髁外側進行皮膚切口，并進行股四頭肌鈍性解剖以暴露股骨干骺端。然后制作一個直徑2.5 mm圓形缺損。分別植入通過注入鹽水沖洗孔，以從空腔中去除骨碎片，CPC組、BCPC組和BSCPC組分別植入相對應的材料。隨后使用縫線逐層縫合筋膜和皮膚。

1.4 樣本的收集和檢測 各組大鼠在缺損術后8周用過量水合氯醛將大鼠安樂死。收集雙側股骨，清除黏附的軟組織，將右股骨用冰浸在鹽水中的紗布包裹。

使用乙二胺四乙酸(Sigma-Aldrich，Saint Louis，USA)將股骨樣品脫鈣8周，將脫鈣的骨樣品包埋在石蠟中并使用蘇木素(Hematoxylin)和伊紅(Eosin)染色后用顯微鏡(Nikon Eclipse 80i，Tokyo，Japan)檢查組織切片。

使用微計算機斷層掃描(Micro-CT； Y.Cheetah； YXLON International GmbH，德國)評估骨缺損愈合的影響。使用VG Studio 2.1 V軟件(版本2.6)對股骨進行掃描，并對18 μm(像素)處的管電壓為80 kV且電流為60 μA的X射線進行成像。在180°的角度范圍內總共獲取了450個投影。使用基于Feldkamp算法(Sky Scan)的錐束重建軟件重建圖像切片。定義了標準化的三維關注區(qū)域，其圓柱形狀為3 mm長和2.5 mm直徑。獲得骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)來自于Micro-CT的3D渲染圖像。

左側股骨缺損區(qū)域在冰冷裂解緩沖液中勻漿。蛋白濃度用BCA蛋白分析試劑盒(Thermo Scientific)定量。用SDS-PAGE在812%聚丙烯酰胺凝膠上分離等量的總蛋白，并將其轉移到硝化纖維素膜。免疫印跡與一抗包括Notch(Ab15251)和RUNX-2(Ab23981)；CBF 1(Ab15345)和Jagged 1(Ab15341)。在4℃下孵育過夜，然后與相應的二抗在室溫下孵育1 h。用ECL-plus試劑對斑點進行可視化，并用Lab Image Version 2.7.1對結果進行量化。

2 結果

2.1 造模結果 由于麻醉感染OVX組共5只大鼠死亡，去卵巢術后Sham組及OVX各亞組均隨機選取5只大鼠。腰椎(L2～L4)的骨密度(bone mineral density，BMD)通過雙能X射線吸收法(Lunar Prodigy Advance，GE Lunar，Madison,WI,USA)在麻醉下進行檢測。Sham和OVX組的BMD分別為(225.54±28.35)mg/cm2和(162.45±25.33)mg/cm2。在定量分析中，Sham組的骨密度比OVX組高27.97%(t=3.711，P=0.006)；這些結果證實了去卵巢誘導骨質疏松癥模型建立成功。

2.2 Micro-CT分析 缺損區(qū)域骨小梁的三維重建結果見圖1，骨微觀參數(shù)BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp如表1所示。治療8周后，CPC組、BCPC組和BSCPC組微結構參數(shù)BV/TV、Tb.Th、Tb.N高于Con組，而Tb.Sp低于Con組(P<0.05)；同時發(fā)現(xiàn)CPC、BCPC和BSCPC組之間的BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且BSCPC組缺損區(qū)域具有最佳的微觀參數(shù)BV/TV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp。

A：Con組；B：CPC組；C：BCPC組；D：BSCPC組。

表1 Micro-CT分析檢測BV/TV、Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th指標比較

2.3 組織學分析 術后8周，Con組缺損被薄而疏松的結締組織填充，CPC、BCPC和BSCPC組新生骨量多于Con組。與Con組相比，BSCPC組和BCPC組缺損部位被較多的新形成骨組織充填，缺損區(qū)被修復較多，但是可見較多的生物材料殘留。與CPC或BCPC組相比，BSCPC組缺損部位從缺損邊緣到中心均可見大量的骨組織形成，可見較多成熟骨組織，只有較少的生物材料殘留(圖2)。

2.4 蛋白印跡分析 結果顯示，與Con組比較，CPC組、BCPC組和BSCPC組Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2蛋白表達上調(P<0.05)；同時發(fā)現(xiàn)CPC、BCPC和BSCPC組之間的Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且BSCPC組缺損區(qū)域Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2表達上調最為明顯。見圖3和表2。

A：Con組；B：CPC組；C：BCPC組；D：BSCPC組。紅色箭頭：新生骨組織；黃色箭頭:未吸收材料。

圖3 Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2的蛋白表達檢測結果

表2 檢測Notch 1、CBF 1、Jagged 1和RUNX-2的蛋白表達比較

3 討論

CPC因其抗壓強度，出色的生物相容性和骨傳導性及可吸收性而在支架材料中脫穎而出。盡管具有上述優(yōu)點，但缺乏骨誘導性是CPC的關鍵缺陷之一，這可能導致骨不連，特別是在修復骨質疏松骨缺損方面。作為最具代表性的骨生長因子，BMP-2已獲得美國食品和藥物管理局(FDA)和歐洲藥品管理局(EMEA)的批準，用于治療骨不連或者促進脊柱融合[10]。Sr在元素周期表中與鈣元素屬于同族元素，Sr能有效抑制破骨細胞，同時促進成骨細胞的活性。因此，Sr元素一直作為骨質疏松研究領域中的“明星”元素；一方面，在成骨細胞富集的細胞中，能增大膠原蛋白與非膠原蛋白的合成，通過增強前成骨細胞的增殖而促進成骨細胞介導的骨形成。另一方面，能劑量依賴地抑制前破骨細胞的分化，從而抑制破骨細胞介導的骨吸收[11]。

在目前的工作中，我們通過將Sr2+和BMP-2引入CPC來增強骨骼組織生長，從而開發(fā)出完善的CPC骨骼替代材料。為了開發(fā)一系列SCPC，將碳酸鍶(SrCO3)顆粒與不同含量(0和5 wt.%)的CPC粉末均勻混合[12]。雖然更高劑量的BMP-2可以取得更好的結果，但是顯著增加不良反應的發(fā)生率，如逆行射精，抗體形成，神經根炎，術后神經根損傷，異位骨化，血腫形成，傷口愈合并發(fā)癥和新發(fā)腫瘤等風險[13]。在本研究中，我們觀察到較低劑量BMP-2復合Sr修飾CPCP可以改善BMP-2復合CPCP修復骨缺損效果。與CPC和BCPC組相比，BSCPC治療骨缺損時，骨組織形成迅速，Mciro-CT檢測結果顯示具有較高BV/TV、Tb.N和Tb.Th及較低Tb.Sp，這表明BSCPC修復骨缺損效果更佳。

研究表明Notch 信號通路不僅影響血管內皮細胞和血管形成[14]，而且在骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化及成骨過程中作用巨大[15]。因此Notch信號通路對血管內皮細胞影響和血管的生成、以及對成骨細胞功能和在骨修復過程中都有重要的作用。RUNX-2在骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化及成骨過程中也起到重要作用。本研究使用蛋白印跡觀察Notch信號通路Notch 1、CBF 1和Jagged 1和RUNX-2表達情況，結果發(fā)現(xiàn)BSCPC組的RUNX-2、Notch 1、CBF 1和Jagged 1蛋白表達水平高于CPC和BCPC組，表明BMP-2復合Sr修飾CPC材料修復骨質疏松骨缺損可能和Notch信號通路激活和RUNX-2表達上調有關。

這項關于臨界骨缺損修復的研究結果表明，將BMP-2修飾摻鍶CPC將有望快速實現(xiàn)骨質疏松性骨缺損修復。但具體機制和最佳組合劑量還需要進一步研究。