李苒苒,陸文睿,陶 敏,丁文潔,王李卓,李 碩,何蓮芝

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241001；3.皖南醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

宮頸癌是全世界女性發(fā)病的第四大常見癌癥[1]，現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅女性生命健康的疾病之一，目前宮頸癌的治療以手術(shù)為主，放化療為輔。晚期宮頸癌的治療效果較差，多以放化療為主要手段；但是，抗癌藥物帶來的如骨髓抑制、胃腸道毒性和腎臟損害等副作用仍然是目前需要解決的關(guān)鍵問題。因此，開發(fā)研究植物類抗癌藥物成為目前的研究熱點(diǎn)。傳承數(shù)千年的藥用植物因其副作用少成為臨床藥物開發(fā)的首選。青蒿素[2]是一種有效的抗瘧藥，是從傳統(tǒng)中草藥青蒿中分離來的，而雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是青蒿素衍生物的主要活性代謝物，展示出青蒿素衍生物中最強(qiáng)的抗癌作用[3-4]，研究表明DHA可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[5]，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DHA影響了hela細(xì)胞的增殖和遷移，并初步探討其對(duì)TNF-α/NF-κB信號(hào)通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 hela細(xì)胞：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所； DHA、Cell Counting Kit-8(CCK8)、100 U/mL青霉素-0.1 mg/mL鏈霉素(美國(guó)Solarbio)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(韓國(guó)Biosharp)； Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Ki(廣州銳博)；TNF-α、TNFR1及TNFR2(Proteintech)；β-actin(Sigma)；NF-κB p65(Cell Signaling Technology)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) hela細(xì)胞在添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素-0.1 mg/mL 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2條件培養(yǎng)箱中促進(jìn)生殖傳代，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代后繼續(xù)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hela細(xì)胞密度為3×104/mL接種于96孔板培養(yǎng)， DHA用DMEM培養(yǎng)液稀釋成濃度為0、10、20、30、40、60 μmol/L，分成6組處理細(xì)胞，每組4個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)12、24、36 h時(shí)加入10%的CCK8試劑，后繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度,計(jì)算半抑制濃度IC50。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 以每孔2×105/mL的密度將hela接種于六孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到100%時(shí)，以消毒的200 μL槍頭對(duì)準(zhǔn)無菌直尺于六孔板中垂直劃數(shù)條泳道，用PBS清洗3次，分為對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)液)和實(shí)驗(yàn)組(20 μmol/L DHA)，分別于培養(yǎng)12、24、36 h時(shí)拍照，每組取3處測(cè)量劃痕位置的寬度(即劃痕面積)，計(jì)算細(xì)胞的遷移率=(0 h劃痕面積-某時(shí)間點(diǎn)劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法 分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組(20及30 μmol/L DHA)，分別干預(yù)細(xì)胞36 h后提取細(xì)胞蛋白：經(jīng)藥物處理后的貼壁細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌3次，加入適量的蛋白裂解液裂解，后收集裂解的細(xì)胞至1.5 mL EP 管，使用細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，繼續(xù)置于冰上靜置30 min，隨后4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，即為細(xì)胞總蛋白。按照蛋白80 μg/孔上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗于4℃冰箱過夜，次日1×TBST洗滌一抗，共3次，每次10 min，后二抗室溫孵育2 h，1×TBST洗滌，每次10 min，共3次，曝光，Image J 分析灰度值。

1.2.5 EdU細(xì)胞增殖檢測(cè) 細(xì)胞干預(yù)36 h后，將hela細(xì)胞于EdU培養(yǎng)基(50 μmol/L)中孵育2 h，然后根據(jù)Ribobio的Cell-Light EdU細(xì)胞增殖試劑盒的實(shí)驗(yàn)說明書，將細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定10 min，用0.5%Triton-X-100增強(qiáng)穩(wěn)定性，并用Apollo?熒光染料染色。然后即可在熒光倒置顯微鏡上觀察拍照。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，作圖使用Graphpad軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK8檢測(cè)DHA對(duì)hela細(xì)胞活力的影響 干預(yù)12、24和36 h后，不同濃度DHA處理的hela細(xì)胞存活率呈逐漸降低趨勢(shì)，在12 h時(shí)變化趨勢(shì)相對(duì)不明顯，而處理24和36 h的細(xì)胞活力隨著DHA濃度的增加而降低(表1)。該結(jié)果表明DHA對(duì)hela細(xì)胞的作用呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性，計(jì)算出細(xì)胞處理24及36 h的半抑制濃度(IC50)分別為：28.48 μmol/L (95%CI:25.17 ～32.24 μmol/L)；22.44 μmol/L(95%CI:14.18 ～ 35.52 μmol/L)。根據(jù)結(jié)果我們選擇20 μmol/L DHA處理細(xì)胞36 h進(jìn)行后續(xù)EdU實(shí)驗(yàn)。

表1 不同濃度組DHA對(duì)hela細(xì)胞活力的影響

2.2 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHA對(duì)hela細(xì)胞增殖的影響 EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DHA處理后可見hela細(xì)胞明顯的核皺縮，細(xì)胞核輪廓不清(圖1)，細(xì)胞增殖率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0058，<0.01)。

2.3 DHA抑制hela細(xì)胞的遷移 選取20 μmol/L DHA處理hela細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(圖2)，結(jié)果表明，DHA處理后的hela細(xì)胞較對(duì)照組的創(chuàng)口愈合速度更慢(表2),表明DHA可以抑制hela細(xì)胞的遷移。

NC組：正常培養(yǎng)的hela細(xì)胞；DHA組：使用20 μmol/L的DHA處理36 h，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞增殖(20×)。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHA對(duì)hela細(xì)胞遷移能力的影響

表2 兩組hela細(xì)胞的遷移情況(n=3)

2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)DHA對(duì)hela細(xì)胞TNF-α/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響 以20 μmol/L和30 μmol/L DHA刺激hela細(xì)胞36 h，結(jié)果顯示，細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、TNFR1、TNFR2在藥物處理組表達(dá)降低，與此同時(shí)NF-κB的表達(dá)在藥物處理后也降低(圖3)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)DHA對(duì)hela細(xì)胞的影響

表3 DHA對(duì)細(xì)胞中炎癥相關(guān)因子的影響(n=4)

3 討論

宮頸癌是一種高發(fā)的惡性腫瘤，是嚴(yán)重威脅女性健康的重要疾病[6]。宮頸癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的中晚期患者手術(shù)效果差，順鉑、卡鉑、紫杉醇等常用化療藥物的藥物毒性大，副作用嚴(yán)重。近年來，中醫(yī)藥所帶來的抗腫瘤效果受到了廣泛的關(guān)注，作為FDA批準(zhǔn)的青蒿素衍生物的抗瘧藥，DHA可以通過調(diào)節(jié)氧化還原穩(wěn)態(tài)而成為一種有效的抗癌藥物[7]。目前已有的關(guān)于DHA的抗癌治療研究包括肝癌[8]、膽囊癌[9]、乳腺癌[10]等。有研究表明，DHA可用于治療人乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致的上皮內(nèi)病變，包括一系列發(fā)展成贅生物的病變[11]，作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]，抑制血管生成并增強(qiáng)了對(duì)放射線和抗癌藥的敏感性[12]。但對(duì)于DHA在治療宮頸癌中的具體機(jī)制尚無定論性的研究。本研究中，我們研究了DHA對(duì)hela細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制，首先通過CCK8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著DHA濃度升高，細(xì)胞存活率不斷下降，延長(zhǎng)DHA的作用時(shí)間后存活細(xì)胞也不斷減少，說明DHA抑制了hela細(xì)胞的增殖并呈劑量和時(shí)間依賴性，隨后EdU實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DHA處理后細(xì)胞核發(fā)生皺縮，增殖細(xì)胞數(shù)量明顯減少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了DHA明顯抑制了hela細(xì)胞的增殖，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DHA抑制了hela細(xì)胞的遷移。

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展主要與宮頸人乳頭瘤病毒感染導(dǎo)致慢性炎癥從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫機(jī)制有關(guān)[13]，包括吞噬作用、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、感染的角質(zhì)形成細(xì)胞觸發(fā)多種促炎細(xì)胞因子所產(chǎn)生[14]， TNF-α是參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的多效性細(xì)胞因子，主要通過與兩個(gè)不同的受體TNF-α受體Ⅰ(TNFR1)和TNF-α受體Ⅱ(TNFR2)的結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡。TNFR1具有細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，大多數(shù)信號(hào)是由TNFR1傳遞的[15]，TNFR2則通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮作用參與宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展[16]。TNF-α通過多種途徑與其受體相互作用，包括通過以核因子κB(NF-κB)依賴的方式誘導(dǎo)編碼抗凋亡分子的基因表達(dá)從而促進(jìn)惡性細(xì)胞的增殖[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNF-α、TNFR1、TNFR2、NF-κB在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)均降低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此認(rèn)為DHA抑制細(xì)胞的增殖與TNF-α/NF-κB有關(guān)，NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,主要以p65和p50兩個(gè)亞基組成的異源二聚體形式存在,當(dāng)細(xì)胞受到炎性因子如TNF-α刺激時(shí),二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與相應(yīng)靶基因上特定的序列結(jié)合,參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控,對(duì)炎癥反應(yīng)起到放大作用[18]。閆錫釗等[19]研究指出宮頸組織癌變過程中TNF-α和TNFR1表達(dá)增強(qiáng),而其作為激活經(jīng)典炎癥途徑NF-κB的上游信號(hào)，可導(dǎo)致宮頸局部組織的持續(xù)性炎癥微環(huán)境，并促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。因此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)TNF-α/NF-κB信號(hào)通路影響了DHA對(duì)宮頸癌的作用，炎癥機(jī)制可能為其主要參與途徑，進(jìn)一步深入研究在宮頸癌細(xì)胞中DHA對(duì)TNF-α/NF-κB信號(hào)通路的影響可能為宮頸癌的防治帶來新的方向。