夏培 熊宇 張萬里 田愛霞 丁祥武 胡艷艷

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其病死率在所有惡性腫瘤中占據(jù)第二，僅次于肺癌[1]?；虻漠惓１磉_(dá)是胃癌發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)原因，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活等[2]。因此，從分子水平闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，探尋可靠的早期診斷標(biāo)志物和新的治療策略具有重要意義。人類轉(zhuǎn)錄因子叉頭框Q1(forkhead box Q1，F(xiàn)OXQ1)基因?qū)儆贔ox轉(zhuǎn)錄因子家族，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其編碼的蛋白質(zhì)由403個氨基酸組成。FOXQ1的生物學(xué)功能已在毛囊分化中得到明確鑒定[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)FOXQ1在肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后顯著相關(guān)[4-6]。近期研究表明，F(xiàn)OXQ1在胃癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與胃癌病理分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]，然而，F(xiàn)OXQ1的高表達(dá)是否有助于胃癌的發(fā)展和進(jìn)展尚不清楚。SHH信號通路參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡以及器官形成等過程[8,9]。近期發(fā)現(xiàn)FOXQ1基因可介導(dǎo)大腸癌SW480細(xì)胞血管生成與SHH信號通路有關(guān)[10]。本實(shí)驗首先檢測了胃癌細(xì)胞系中FOXQ1基因表達(dá)水平，并通過沉默胃癌SGC-7901細(xì)胞FOXQ1基因，觀察該基因?qū)GC-7901細(xì)胞凋亡和SHH信號通路相關(guān)蛋白的影響，探討其是否介導(dǎo)SHH信號通路影響胃癌細(xì)胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑 人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及人胃癌細(xì)胞SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS購自上海中科院細(xì)胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，Trizol試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，非特異性FOXQ1 siRNA和非特異性FOXQ1 siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Bax、Cleaved Caspase3、SHH、Smo、Gli1和Gli3抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購自美國Abcam公司，SHH信號通路的特異性激活劑2,6,9-三取代嘌呤化合物(Purmorphamine，PM)購自美國Cayman公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及人胃癌細(xì)胞SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS均培養(yǎng)于含有100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素及100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件是37℃，5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱。待細(xì)胞密度達(dá)80%以上時，使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，每3～4天傳代1次。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對數(shù)生長期的胃癌SGC-7901細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞。細(xì)胞融合至60%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染特異性FOXQ1 siRNA、非特異性FOXQ1 siRNA至SGC-7901細(xì)胞，命名為si-FOXQ1組和si-Control組，并設(shè)置正常對照組(Normal組)。通過綠色熒光的表達(dá)程度摸索出細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染濃度及轉(zhuǎn)染時間。轉(zhuǎn)染時間為48 h時轉(zhuǎn)染效率最高。收集轉(zhuǎn)染48 h 的各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗。

1.4 qRT-PCR檢測細(xì)胞FOXQ1 mRNA的表達(dá) 按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞中RNA，超微量蛋白核酸檢測儀測定RNA濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，F(xiàn)OXQ1上游引物：5’-CGGAAGAGGACTCCGGAAAAG-3’，下游引物：5’-GTCGTACCCTCTTCCTTCGC-3’。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40個循環(huán)。采用β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計算細(xì)胞中FOXQ1相對表達(dá)量。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，置冰上孵育30 min，收集細(xì)胞中蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒對總蛋白進(jìn)行定量，取50 μg蛋白樣品行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，封閉1 h，加入一抗孵育，Bax一抗1∶500稀釋、Cleaved Caspase3一抗1∶500稀釋、SHH一抗1∶800稀釋、Smo一抗1∶800稀釋、Gli1一抗1∶800稀釋和Gli3一抗1∶800稀釋，4℃過夜孵育，TBST洗膜(3×10 min)，加入二抗孵育(辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗1∶3 000稀釋)2 h，TBST洗膜(3×10 min)，化學(xué)發(fā)光顯色，顯影、定影，在成像系統(tǒng)中拍照，以GAPDH為內(nèi)參，統(tǒng)計細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase3、SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌，加入1×Annexin結(jié)合液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml。取100 μl細(xì)胞懸液，加5 μl Annexin和5 μl PI，室溫避光反應(yīng)15 min，加入400 μl 1×Annexin結(jié)合液，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 激活SHH信號通路對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 用1 μmol/L的SHH特異性激活劑PM誘導(dǎo)si-FOXQ1組細(xì)胞24 h，記為si-FOXQ1+PM組，以si-FOXQ1組細(xì)胞為對照。Western blot檢測細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase3、SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白相對表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 FOXQ1 mRNA在胃癌細(xì)胞中表達(dá) qRT-PCR檢測永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和不同胃癌細(xì)胞系中FOXQ1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，GES-1、SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS細(xì)胞中FOXQ1 mRNA相對表達(dá)水平分別為(1.00±0.11)、(3.16±0.33)、(2.27±0.26)、(1.92±0.21)、(2.44±0.25)。與GES-1細(xì)胞比，胃癌細(xì)胞SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS中FOXQ1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，并且胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)量最高，因此選擇SGC-7901細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗研究對象。

2.2 轉(zhuǎn)染FOXQ1 siRNA對SGC-7901細(xì)胞中FOXQ1基因表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染si-FOXQ1、si-Control至SGC-7901細(xì)胞，qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，si-FOXQ1組SGC-7901細(xì)胞中FOXQ1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著低于si-Control組(P<0.05)。si-Control組和Normal組間FOXQ1 mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1,表1。

圖1 SGC-7901細(xì)胞中FOXQ1蛋白表達(dá)條帶

表1 SGC-7901細(xì)胞中FOXQ1mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.3 轉(zhuǎn)染FOXQ1 siRNA誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡 采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與si-Control組比較，si-FOXQ1組SGC-7901細(xì)胞凋亡率、Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。si-Control組和Normal組細(xì)胞凋亡率及Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2,表2。

圖2 轉(zhuǎn)染FOXQ1 siRNA對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響；A 流式細(xì)胞儀檢測3組SGC-7901細(xì)胞凋亡；B Western blot檢測3組SGC-7901細(xì)胞中Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)情況

表2 SGC-7901細(xì)胞凋亡率及Bax和Cleaved Caspase3蛋白水平比較

2.4 激活SHH信號通路對胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 使用SHH特異性激活劑PM處理轉(zhuǎn)染si-FOXQ1的SGC-7901細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，si-FOXQ1組比，si-FOXQ1+PM組SGC-7901細(xì)胞中SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平顯著升高(t1=9.327，t2=4.287，t3=7.746，t4=6.971，P<0.05)；細(xì)胞凋亡率、Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)顯著降低(t1=6.000，t2=6.242，t3=10.651，P<0.05)。見表3,圖3。

圖3 激活SHH信號通路對胃癌細(xì)胞凋亡的影響;A 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率；B Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá)

表3 2組SGC-7901細(xì)胞凋亡率及蛋白表達(dá)水平比較

2.5 轉(zhuǎn)染FOXQ1 siRNA對SHH信號通路的影響 3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，采用Western blot檢測SHH信號通路關(guān)鍵蛋白及下游分子表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與si-Control組比較，si-FOXQ1組SGC-7901細(xì)胞中SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。si-Control組與Normal組比較，SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4,表4。

圖4 SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)條帶

表4 3組SGC-7901細(xì)胞中SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白水平

3 討論

FOXQ1是一種轉(zhuǎn)錄因子，作為致癌基因在癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用，日益收到研究者們的關(guān)注[11]。研究表明，F(xiàn)OXQ1在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肝細(xì)胞癌等癌癥中表達(dá)升高，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-14]。FOXQ1過表達(dá)通過促進(jìn)膀胱癌和乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化活性來增強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移，并且沉默F(xiàn)OXQ1可抑制膀胱癌和乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[15,16]。Zhang等[17]研究顯示，F(xiàn)OXQ1通過調(diào)控BCL11A/MDM2的表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，并抑制其增殖。然而，F(xiàn)OXQ1對胃癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXQ1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著升高，提示FOXQ1基因可能在胃癌的發(fā)展中發(fā)揮致癌作用。沉默F(xiàn)OXQ1表達(dá)，SGC-7901細(xì)胞的凋亡率升高，提示抑制FOXQ1表達(dá)可誘導(dǎo)為癌細(xì)胞凋亡。鄧大煒等[18]研究顯示沉默F(xiàn)OXQ1表達(dá)可誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡，這與本研究結(jié)果一致。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡過程，主要由Caspase介導(dǎo)，其中Caspase3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，Caspase3激活形成Cleaved Caspase3可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡[19]。Bax是主要的細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因，其過度表達(dá)可使細(xì)胞趨于死亡[20]。本研究結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)OXQ1表達(dá)，SGC-7901細(xì)胞中Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，提示抑制FOXQ1的表達(dá)可能通過上調(diào)Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡。

SHH信號通路由SHH、Smo及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Gli3蛋白等組成，與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，特異性阻斷SHH信號通路能夠有效抑制胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[21]。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2抑制SHH可體外誘導(dǎo)成神經(jīng)管細(xì)胞瘤干細(xì)胞凋亡[22]。FOXQ1可通過調(diào)控SHH信號通路促進(jìn)自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和生長，且阻斷SHH信號通路可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。但關(guān)于FOXQ1是否介導(dǎo)SHH信號通路影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為還未知。本研究結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)OXQ1表達(dá)后，SGC-7901細(xì)胞中SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，與文獻(xiàn)報道結(jié)果[23]一致，提示胃癌SGC-7901細(xì)胞FOXQ1可能通過上調(diào)SHH信號通路及下游靶基因發(fā)揮作用。為驗證該結(jié)論，本研究采用SHH信號通路特異性激活劑處理沉默F(xiàn)OXQ1后的SGC-7901細(xì)胞，結(jié)果顯示，加入SHH信號通路特異性激活劑可部分逆轉(zhuǎn)沉默F(xiàn)OXQ1對SGC-7901細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用，進(jìn)一步說明FOXQ可能通過介導(dǎo)SHH信號通路誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡。

綜上，F(xiàn)OXQ1在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，沉默F(xiàn)OXQ1表達(dá)誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與SHH信號通路有關(guān)。FOXQ1基因可能成為胃癌治療的有效作用靶點(diǎn)，為胃癌的分子機(jī)制提供了新的見解，并為胃癌的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。