惠繼星，岳 軍，寧艷春，陳希海，王 碩，屈海峰，胡世洋，范 銳

(1.中國(guó)石油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132021；2.吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林 吉林 132101)

近年來(lái)，隨著國(guó)家對(duì)定點(diǎn)燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)補(bǔ)貼標(biāo)準(zhǔn)的逐步降低，乙醇發(fā)酵工業(yè)更多將焦點(diǎn)放在提高生產(chǎn)效益，降低生產(chǎn)成本[1-4]。據(jù)公開(kāi)文獻(xiàn)測(cè)算，發(fā)酵醪乙醇體積分?jǐn)?shù)(玉米為原料)每提高1%，乙醇收益增加30～40元/t[5]，乙醇濃醪發(fā)酵一般是指φ(乙醇)>12%的發(fā)酵生產(chǎn)[6]，采用濃醪發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇對(duì)生產(chǎn)企業(yè)提高效益，降低能耗，提高設(shè)備利用率，保護(hù)環(huán)境具有積極的促進(jìn)作用，目前已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)酒精行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)[7]。

氮源是制約玉米酒精發(fā)酵速率和成熟醪酒份的主要因素，在傳統(tǒng)的酒精生產(chǎn)中，酵母生長(zhǎng)所需要的氮源采用尿素。隨著GB2760—2014的實(shí)施，尿素禁止在食用乙醇生產(chǎn)過(guò)程中使用[8]。對(duì)于玉米燃料乙醇生產(chǎn)企業(yè)而言，尿素可能會(huì)隨著副產(chǎn)品(玉米酒糟飼料DDGS)進(jìn)入食品環(huán)節(jié)，威脅人體健康，因此玉米乙醇領(lǐng)域急需開(kāi)發(fā)出替代尿素的新型氮源[9-10]。以玉米為原料生產(chǎn)酒精時(shí)，在發(fā)酵過(guò)程中添加適量的酸性蛋白酶，能有效地水解原料中的蛋白質(zhì)，破壞原料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，利于糖化酶的作用，使原料中可利用的糖增加，提高出酒率。同時(shí)，由于蛋白酶的水解作用，增加了醪液中可被酵母利用的有機(jī)氮，促進(jìn)酵母的生長(zhǎng)和繁殖，增強(qiáng)酵母菌的產(chǎn)酒能力，提高發(fā)酵速度，縮短發(fā)酵周期[11]。有關(guān)酸性蛋白酶應(yīng)用方面的報(bào)道較多，但是將酸性蛋白酶應(yīng)用于玉米燃料乙醇濃醪發(fā)酵的報(bào)道較少。作者研究了玉米糖化醪初始pH值、w(糖化醪干物)、酸性蛋白酶添加量等條件對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響，得到較適宜的w(糖化醪干物)和酸性蛋白酶添加量，為玉米燃料乙醇濃醪發(fā)酵的中試放大及工業(yè)化實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料、試劑與儀器

玉米粉、酸性蛋白酶：酶活力5×104U/mL，糖化酶：10×104U/mL；耐高溫α-淀粉酶：24×104U/mL，均為市售；超級(jí)釀酒高活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司。

磷酸：遼寧新興試劑有限公司；氫氧化鈉：北京化工廠；均為分析純。

立式全溫振蕩培養(yǎng)箱：ZQPL-200，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；潔凈工作臺(tái)：SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋：MJ-78A，施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；離心機(jī)：A14，Sartorius公司；液相色譜：LC-20A，日本島津公司；數(shù)字酸度計(jì)：PP-25-P11，Sartorius公司；快速水分測(cè)定儀：MS-70，日本AND公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料液化、糖化

按照一定的w(糖化醪干物)，將市售玉米粉用60～70 ℃溫水調(diào)漿；95 ℃糊化液化120 min，液化酶加量為30 U/g玉米粉；60 ℃恒溫糖化60 min，糖化酶加量為70 U/g玉米粉，得到玉米糖化醪。

1.2.2 pH值調(diào)整

利用磷酸、氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)玉米糖化醪的pH值。

1.2.3 酵母活化

稱量0.3 g安琪超級(jí)釀酒高活性干酵母，加入裝有100 mL無(wú)菌水的三角瓶中，在t=32 ℃、n=180 r/min的搖床中活化60 min。

1.2.4 發(fā)酵

向100 mL玉米糖化醪中加入1 mL酵母活化液，加入適量的酸性蛋白酶，在n=180 r/min、t=32 ℃的條件下開(kāi)始發(fā)酵。

1.3 分析方法

1.3.1φ(乙醇)和ρ(葡萄糖)測(cè)定

取發(fā)酵液樣品1.8 mL加入2.0 mL離心管中，n=12 000 r/min，離心3 min，取上清液稀釋10倍，然后用0.22 μm的水系濾膜過(guò)濾，用液相色譜儀(檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器；流速：0.6 mL/min；流動(dòng)相：0.005 mol/L硫酸；柱溫：55 ℃)測(cè)定發(fā)酵液中φ(乙醇)和ρ(葡萄糖)，按公式(1)、(2)計(jì)算。

φ(乙醇)=φ×稀釋倍數(shù)/100

(1)

ρ(葡萄糖)=φ×稀釋倍數(shù)/100

(2)

式中：φ為測(cè)定值。

1.3.2w(糖化醪干物)測(cè)定

w(糖化醪干物)的測(cè)定參照GB/T2793—1995，干燥溫度為105 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始pH值對(duì)酸性蛋白酶作用效果的影響

在w(糖化醪干物)=27%、酸性蛋白酶添加量為 0.10 kg/t干物的條件下，考察了發(fā)酵液的初始pH值對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響，發(fā)酵前后發(fā)酵液pH值的變化見(jiàn)表1，發(fā)酵液中φ(乙醇)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖1，ρ(葡萄糖)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖2。

表1 發(fā)酵前后各發(fā)酵液的pH值

t/h圖1 φ(乙醇)隨時(shí)間的變化

t/h圖2 ρ(葡萄糖)隨時(shí)間的變化

由表1可知，發(fā)酵后各實(shí)驗(yàn)的pH值均較發(fā)酵前有所降低，表明乙醇發(fā)酵是產(chǎn)酸的過(guò)程。由圖1、圖2可知，初始pH=3.5～6.0的φ(乙醇)曲線和ρ(葡萄糖)曲線均發(fā)生了重疊，表明初始pH=3.5～6.0對(duì)酸性蛋白酶作用效果的影響差別不大；當(dāng)發(fā)酵液的初始pH=3.0時(shí)，相對(duì)于初始pH=3.5～6.0發(fā)酵液的φ(乙醇)明顯降低，相應(yīng)發(fā)酵液中ρ(葡萄糖)明顯升高，表明當(dāng)發(fā)酵液初始pH<3.5會(huì)對(duì)酸性蛋白酶的作用效果產(chǎn)生不良影響，因此發(fā)酵液初始pH值不宜低于3.5。由于糖化醪的初始pH=5.5，因此酸性蛋白酶適宜于玉米燃料乙醇發(fā)酵，在酸性蛋白酶的應(yīng)用過(guò)程中無(wú)需對(duì)發(fā)酵液的pH值進(jìn)行調(diào)整。

2.2 w(糖化醪干物)對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響

在w(糖化醪干物)=27%、29%、31%、33%、35%，不添加酸性蛋白酶的條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液中φ(乙醇)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖3，ρ(葡萄糖)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖4。

t/h圖3 φ(乙醇)隨時(shí)間的變化

t/h圖4 ρ(葡萄糖)隨時(shí)間的變化

由圖3、圖4可知，隨著w(糖化醪干物)的增大，最終發(fā)酵液中φ(乙醇)逐漸升高，φ(乙醇)達(dá)到最大值的時(shí)間后移，發(fā)酵周期延長(zhǎng)。w(糖化醪干物)=27%，發(fā)酵液中φ(乙醇)在48 h達(dá)到最大值11.5%；w(糖化醪干物)分別為29%、31%時(shí)，發(fā)酵液中φ(乙醇)均在56 h達(dá)到最大，分別為12.7%、13.8%；w(糖化醪干物)=33%，發(fā)酵液中φ(乙醇)在72 h達(dá)到最大值14.1%，此時(shí)ρ(葡萄糖)=1.0 g/L；w(糖化醪干物)=35%，發(fā)酵液中φ(乙醇)在56 h達(dá)到最大值13.9%，發(fā)酵停止，此時(shí)為ρ(葡萄糖)=37.2 g/L，表明當(dāng)w(糖化醪干物)過(guò)高時(shí)，物料的流動(dòng)性變差，醪液在攪拌、輸送和加熱冷卻時(shí)都變得十分困難，不利于酵母菌的生長(zhǎng)繁殖[12-14]。

2.3 酸性蛋白酶對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響

在w(糖化醪干物)=27%、29%、31%、33%、35%，每100 mL糖化醪中添加4 μL酸性蛋白酶的條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液中φ(乙醇)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖5，ρ(葡萄糖)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖6。

t/h圖5 φ(乙醇)隨時(shí)間的變化

t/h圖6 ρ(葡萄糖)隨時(shí)間的變化

由圖5、圖6可知，當(dāng)w(糖化醪干物)分別為27%、29%、31%、33%時(shí)，發(fā)酵液中φ(乙醇)均在48 h達(dá)到最大，分別為11.5%、12.6%、13.8%、14.6%；當(dāng)w(糖化醪干物)=35%時(shí)，發(fā)酵液中φ(乙醇)在56 h達(dá)到最大14.7%，此時(shí)發(fā)酵液中ρ(葡萄糖)為17.7 g/L，表明添加酸性蛋白酶改善了發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)狀況，促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，有利于提高乙醇發(fā)酵速率，但是當(dāng)w(糖化醪干物)過(guò)高時(shí)，較高的φ(乙醇)是抑制酵母菌的生長(zhǎng)繁殖的主要因素。

2.4 酸性蛋白酶對(duì)乙醇發(fā)酵周期的影響

對(duì)不同w(糖化醪干物)條件下添加酸性蛋白酶和空白實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵周期及發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)φ(乙醇)和ρ(葡萄糖)進(jìn)行了對(duì)比分析，酸性蛋白酶對(duì)乙醇發(fā)酵周期的影響見(jiàn)表2， 酸性蛋白酶對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)φ(乙醇)的影響見(jiàn)表3，酸性蛋白酶對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)ρ(葡萄糖)的影響見(jiàn)表4。

表2 添加酸性蛋白酶對(duì)乙醇發(fā)酵周期的影響1)

由表2可知，隨著w(糖化醪干物)的增大，空白實(shí)驗(yàn)和添加酸性蛋白酶實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵周期均明顯增長(zhǎng)；當(dāng)w(糖化醪干物)相同時(shí)，添加酸性蛋白酶實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵周期均較空白實(shí)驗(yàn)明顯縮短；隨著w(糖化醪干物)的增大，添加酸性蛋白酶實(shí)驗(yàn)較空白實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵周期縮短值明顯增大，表明添加酸性蛋白酶更適合于乙醇濃醪發(fā)酵，作用效果尤為顯著，為濃醪發(fā)酵所不可缺少。

表3 酸性蛋白酶對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)φ(乙醇)的影響1)

表4 酸性蛋白酶對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)ρ(葡萄糖)的影響

由表3、表4可知，當(dāng)w(糖化醪干物)=27%～33%時(shí)，較空白實(shí)驗(yàn)，添加酸性蛋白酶可提高發(fā)酵成熟醪中φ(乙醇)=0.1%～0.5%，降低ρ(葡萄糖)=0.02～0.50 g/L；w(糖化醪干物)=35%，發(fā)酵成熟醪中φ(乙醇)較空白實(shí)驗(yàn)提高0.7%，ρ(葡萄糖)降低19.5 g/L，此時(shí)的φ(乙醇)與w(糖化醪干物)=33%相同，經(jīng)濟(jì)性較差，因此選擇w(糖化醪干物)=33%較佳。

2.5 酸性蛋白酶添加量的優(yōu)化

在w(糖化醪干物)=33%，酸性蛋白酶添加量為0～0.18 kg/t干物的條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液中φ(乙醇)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖7，ρ(葡萄糖)隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖8。

酸性蛋白酶添加量/(kg·t-1干物)圖7 φ(乙醇)隨時(shí)間的變化

酸性蛋白酶添加量/(kg·t-1干物)圖8 ρ(葡萄糖)隨時(shí)間的變化

由圖7、圖8可知，發(fā)酵24～36 h，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，發(fā)酵液中φ(乙醇)逐漸上升，當(dāng)酸性蛋白酶添加量大于0.09 kg/t干物時(shí)，發(fā)酵液中φ(乙醇)增長(zhǎng)緩慢；發(fā)酵48～72 h，當(dāng)酸性蛋白酶添加量為0.09 kg/t干物時(shí)，發(fā)酵液中φ(乙醇)達(dá)到最大值14.6%，繼續(xù)增大酸性蛋白酶添加量φ(乙醇)不再上升，因此酸性蛋白酶的適宜添加量為0.09 kg/t干物。

3 結(jié) 論

發(fā)酵成熟醪φ(乙醇)并不隨w(糖化醪干物)和酸性蛋白酶添加量的增加而增大，酸性蛋白酶更適合于乙醇濃醪發(fā)酵。優(yōu)化的玉米濃醪發(fā)酵工藝為酸性蛋白酶添加量0.09 kg/t干物，w(糖化醪干物)=33%，糖化醪初始pH值(自然)無(wú)需調(diào)整，在以上條件下，發(fā)酵成熟醪中φ(乙醇)可達(dá)14.6%，發(fā)酵周期縮短24 h。