柴成朋 張宏坤

摘要： ?燃料乙醇作為新型能源的替代品，近年來(lái)備受世界各國(guó)的青睞。而使用豐富且低廉的玉米秸稈資源代替供應(yīng)糧制備燃料乙醇，這在很大程度上減輕了國(guó)內(nèi)糧食供應(yīng)不足的現(xiàn)狀，與此同時(shí)，它也能夠推動(dòng)國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展，并降低焚燒過(guò)程對(duì)環(huán)境污染所造成的負(fù)面影響。在這里本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)采用玉米秸稈作為生產(chǎn)燃料乙醇的原料，它不僅成本低，而且生長(zhǎng)周期短、易于獲得。玉米秸稈主要成分是由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素組成，此外還含有灰分、少量的蛋白質(zhì)。而木質(zhì)素與纖維素在空間上會(huì)通過(guò)共價(jià)鍵形成特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，因此在水解過(guò)程中會(huì)很大程度上較低水解的活性。因此，在這里本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)采用酸性高溫條件下進(jìn)行水解，使其克服共價(jià)鍵斷裂所需的能壘形成單糖，并利用直接滴定法測(cè)定酸性條件下不同溫度條件下還原糖含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，得出在酸性條件下，增加水解溫度可以加快多糖的水解開環(huán)，形成新的游離羥基，使纖維素的結(jié)晶度降低進(jìn)而轉(zhuǎn)化為單糖 。只有將玉米秸稈中纖維素與木質(zhì)素充分降解為還原糖，才能夠使其在低酸性條件下進(jìn)行菌株發(fā)酵制備燃料乙醇。這樣不僅很大程度上保護(hù)了菌株發(fā)酵的活性，而且使能還原糖高效的轉(zhuǎn)化為燃料乙醇。利用氣相質(zhì)譜分析的方法，通過(guò)質(zhì)譜碎片峰與總離子流圖結(jié)合分析，確定產(chǎn)物中含有乙醇分子

關(guān)鍵詞：玉米秸稈;氣相色譜—質(zhì)譜;燃料乙醇;還原糖;曲霉

針對(duì)玉米秸稈中木質(zhì)素與纖維素在空間上通過(guò)共價(jià)鍵形成的特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，加之不同的纖維素存在著不同的晶體結(jié)構(gòu)、以及原料內(nèi)孔面積，這將使在水解過(guò)程中需要消耗很多能量才能克服斷裂共價(jià)鍵所需的活化能[1-3]。所以，如何選取有效的水解玉米秸稈的方案將成為一個(gè)首要解決的問(wèn)題，在傳統(tǒng)過(guò)程中，常采用酶解、物理爆破、低酸度水解的方案去處理玉米秸稈，這在很大的程度上都不能徹底將玉米秸稈水解，因此，本實(shí)驗(yàn)采用強(qiáng)酸高溫水解的方法進(jìn)行對(duì)玉米秸稈水解。其中采用控制不同溫度水解的方法是本研究的一個(gè)亮點(diǎn)[4-6]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在相同時(shí)間作用下，通過(guò)控制不同水解溫度對(duì)玉米秸稈進(jìn)行水解，可以得出在在高溫條件下可以加快多糖的水解開環(huán)，產(chǎn)生新的游離羥基，使纖維素的結(jié)晶度降低進(jìn)而轉(zhuǎn)化為單糖。同時(shí)，該反應(yīng)是吸熱反應(yīng)，根據(jù)勒夏特列原理，升高溫度有利于反應(yīng)的正向進(jìn)行，進(jìn)而又一步印證了纖維素水解的反應(yīng)速率與升溫有關(guān)。

欲將水解產(chǎn)物進(jìn)行菌株發(fā)酵，就需控制較小酸度才能使菌株存活下來(lái)，從而使菌種在更好的條件發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇。在傳統(tǒng)的釀酒工藝中會(huì)常常加入酒曲，以提高酒的產(chǎn)量和香醇度，該種菌在水解液中可以更好的捕捉糖分進(jìn)行發(fā)酵。曲霉一般可通過(guò)土豆為載體進(jìn)行培養(yǎng)純種，選取長(zhǎng)勢(shì)較好的2-4個(gè)單菌落進(jìn)行分離純化。可以利用微生物自動(dòng)鑒定儀進(jìn)行觀察菌株的分布與長(zhǎng)勢(shì)。根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以得出曲霉存在種間優(yōu)勢(shì)，且繁殖快，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境不是很苛刻，進(jìn)而證明了曲霉在發(fā)酵制備燃料乙醇的過(guò)程中為最佳菌株[7-10]。

一、實(shí)驗(yàn)材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

玉米秸稈取自農(nóng)田、酒曲購(gòu)買于安琪公司

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

氣相—質(zhì)譜聯(lián)用儀、錐形瓶、量筒、燒杯、漏斗、容量瓶、電子天平、移液管、電爐、酸式滴定管

（三）實(shí)驗(yàn)試劑

濃硫酸、0.1%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、菲林甲乙試劑、亞甲基藍(lán)指示劑

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）直接滴定法測(cè)定還原糖

1.空白滴定

準(zhǔn)確移取各5.00mL菲林甲、乙試劑于250mL錐形瓶中，加入約8mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，置于電爐上進(jìn)行加熱至沸騰，以每1-2s一滴的速度滴入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中，直至藍(lán)色消失，記錄消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的總體積（V0）

2.直接滴定

稱取5g粉碎的玉米秸稈置于五個(gè)平行的燒杯錐形瓶中，依次加入不同酸度的濃硫酸溶液，水浴加熱至65，在錐形瓶上放置表面皿（以免加熱過(guò)程中水分流失，增大還原糖濃度，影響測(cè)量結(jié)果），水浴時(shí)間為1小時(shí)，之后冷卻至室溫，將玉米秸稈的水解液通過(guò)漏斗過(guò)濾至錐形瓶中密封保存?zhèn)溆茫渭訅A液使PH調(diào)至中性。將待測(cè)溶液分別移取1mL置于250mL的錐形瓶中，準(zhǔn)確移取菲林甲乙試劑各5.00mL加入其中，搖勻，之后置于電爐上加熱至沸騰，以每1-2s一滴的速度滴加標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，直至溶液藍(lán)色消失，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（V1）

（二）菌株發(fā)酵制備燃料乙醇

通過(guò)直接測(cè)定法，得到水解效果較好的酸度，將已經(jīng)水解好的樣品調(diào)解PH至中性，準(zhǔn)確稱量0.5g酒曲桿菌加入至錐形瓶中，用膠塞將瓶口密封，進(jìn)行無(wú)氧呼吸。控制水浴溫度為35，水浴時(shí)間為72個(gè)小時(shí)，之后將水浴樣品置于陰涼處，避免光線直射，72h后就可以獲得發(fā)酵好的乙醇溶液，再通過(guò)蒸餾裝置將所需的乙醇溶液從混合發(fā)酵溶液中分離出來(lái)。

三、結(jié)果與討論

（一）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法分析樣品液中乙醇分子

在氣相色譜儀部分，采用毛細(xì)管開管柱可以消除渦流擴(kuò)散，同時(shí)管壁上的液膜很薄，也可以極大地降低固定相傳質(zhì)，所以單位柱長(zhǎng)的柱效高，有利于分析較為復(fù)雜樣品，而在質(zhì)譜部分，則采用四極桿質(zhì)量分析器，通過(guò)改變射頻電壓振幅比率或射頻頻率以實(shí)現(xiàn)質(zhì)量掃描，讓質(zhì)荷比不同的離子可以依次抵達(dá)檢測(cè)器，其分辨率很高，且對(duì)樣品分析很快根據(jù)分子特殊離子碎片，麥?zhǔn)现嘏烹x子，就可以在譜庫(kù)檢索中查到質(zhì)譜圖上的分子，同時(shí)與總離子流圖比對(duì)分析，通過(guò)圖1-1和1-2可以得知，在峰A處為乙醇分子峰。

（二）不同溫度下對(duì)玉米秸稈水解的測(cè)定結(jié)果

在一定酸度條件下，控制時(shí)間變量，進(jìn)行測(cè)定不同溫度條件下對(duì)水解率的影響，測(cè)定結(jié)果見表1-1、圖1-3。

在玉米秸稈中，纖維素會(huì)在空間上通過(guò)特殊的共價(jià)鍵相互連接，而想要斷裂共價(jià)鍵就得需要克服很大的能壘，才會(huì)使多糖開環(huán)，產(chǎn)生游離的羥基，加快水解速率，從圖1-3可知，在相同時(shí)刻下，溫度升高可以促進(jìn)玉米秸稈水解，由此可見，溫度的升高對(duì)水解速率成正比，綜合各種因素，從節(jié)能角度和可行性考慮，水解最佳溫度為100℃。

（三）測(cè)定消耗殘?zhí)橇坑谝掖籍a(chǎn)量之間測(cè)定結(jié)果

在無(wú)氧條件下，對(duì)酒曲桿菌消耗培養(yǎng)基中的還原糖進(jìn)行測(cè)定，推斷水解液中還原糖在菌株作用下，殘?zhí)呛颗c乙醇產(chǎn)生之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表1-2和圖1-4。

如圖1-4所示，酒曲桿菌在無(wú)氧呼吸作用下，它會(huì)捕捉培養(yǎng)基中的還原糖補(bǔ)充自身的養(yǎng)分，進(jìn)行繁殖產(chǎn)生更多的后代，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，殘?zhí)橇繒?huì)持續(xù)降低，而自身無(wú)氧呼吸的產(chǎn)物會(huì)持續(xù)升高，他們之間存在著反比關(guān)系。

（四） 培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)乙醇產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果

在不同時(shí)間段內(nèi)，依次利用移液槍從發(fā)酵液中取出5mL樣品，進(jìn)行過(guò)濾處理，之后將處理好的樣品送入氣相色譜，測(cè)定乙醇的含量，數(shù)據(jù)可見表1-3

從圖1-5可知，當(dāng)葡萄糖含量達(dá)到90g/L時(shí)，乙醇的產(chǎn)量達(dá)到峰值，隨著葡萄糖含量的繼續(xù)增加，溶液中的滲透壓持續(xù)升高，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中酒曲桿菌不能有效的進(jìn)行無(wú)氧呼吸，產(chǎn)生乙醇。所以可以得出，在葡萄糖含量達(dá)到90g/L的條件下為最適宜的發(fā)酵條件。

（五）菌落前期培養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果

從圖1-6中可以看出曲霉、毛霉、根霉、孢霉的生長(zhǎng)分布，而曲霉在繁殖過(guò)程中存在種間優(yōu)勢(shì)，繁殖數(shù)量最多且繁殖速率最快，而其他菌種的競(jìng)爭(zhēng)能力較小，且對(duì)生存條件較為苛刻，所以綜上所述，曲霉是最佳菌種。

四、結(jié)論

（一）玉米秸稈的最佳水解溫度的確定

在酸性條件下，針對(duì)玉米秸稈進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，可得出結(jié)論，隨著水解液的溫度不斷提升，可以加快玉米秸稈中纖維素之間共價(jià)鍵的斷裂，迫使游離的羥基裸露出來(lái)，增加親水性，進(jìn)而降低了纖維素的結(jié)晶度，加快多糖的開環(huán)產(chǎn)生單糖。

（二） 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的測(cè)定

利用氣相色譜的在確定的溫度條件下，樣品在惰性的流動(dòng)相與毛細(xì)管柱之間不同分配比的差異，使樣品可以通過(guò)沸點(diǎn)高低的不同，先后從色譜柱中流出，通過(guò)接口部分將樣品流入離子源形成帶電離子，同時(shí)要控制接口的溫度要稍低于柱溫，之后在質(zhì)譜儀部分利用不同的質(zhì)荷比分析出樣品，通過(guò)以上操作，本團(tuán)隊(duì)成功的檢測(cè)樣品中含有乙醇分子。

（三）最佳菌種選擇

通過(guò)多天菌株的培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)從各種菌種中塞選出長(zhǎng)勢(shì)最佳的菌株，酒曲霉素是一種兼性厭氧型菌株，它可以通過(guò)無(wú)氧呼吸降解培養(yǎng)液中的還原糖產(chǎn)生燃料乙醇，根據(jù)沸點(diǎn)不同的特性，則采用蒸餾的方法將其溫度控制在78-79度沸點(diǎn)之間，獲得所需的餾分燃料乙醇。

參考文獻(xiàn)：

[1]孫可偉.固體廢棄物資源化的現(xiàn)狀和展望[J].中國(guó)資源整合利用，2000，（1）：10-13

[2]鄧良偉.纖維素類物質(zhì)生產(chǎn)燃料酒精研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1995，21（5）：69-72

[3]楊斌，高孔榮.甘蔗渣的糖化及轉(zhuǎn)化為酒精的研究概況[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1995，21（6）：61-65

[4]高壽清，生物量制燃料酒精的發(fā)展和需要解決的問(wèn)題[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1991，17（1）：54-59

[5]王桂強(qiáng).淺談從生物質(zhì)制取液體燃料乙醇工藝[J].遼寧化工，1999，28（5）：271-276

[6]呂福英，閔航，陳美慈等。一個(gè)高溫厭氧直接轉(zhuǎn)化纖維素成乙醇的高純富集物[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與自然科學(xué)版），2000，26（1）：56-60

[7]李俊英，張桂，陳學(xué)武等。玉米秸稈的酶水解糖化[J].釀酒，2000，137（2）：52-54

[8]陳艷萍，勇強(qiáng)，劉朝綱等.戊糖發(fā)酵微生物及其選育[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2001，9（3）：57-61

[9]鄭成，松本干治。蔗渣酶解的動(dòng)力學(xué)模型探討[J].化學(xué)反應(yīng)工程與工藝，1997，13（2）：129-135

[10] The effect of biomass moisture content on bioethanol yields from steam pretreated switchgrass and sugarcane bagasse. EWANICK S，BURA R. Bioresource Technology . 2011

基金項(xiàng)目：黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201910234016）

作者簡(jiǎn)介：

張宏坤 （1979-）， 男，黑龍江海倫人，副教授，博士，主要從事有機(jī)與高分子材料合成研究工作。